MALDI-TOF MS对河南地区鸡源沙门菌快速鉴定的研究

王海花 ， 徐耀辉 ， 苗 丽 ， 陈 静 , 李文刚

(1.河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南 郑州 450046 ；2.河南出入境检验检疫局 ， 河南 郑州 450003)

鸡沙门菌是由多个血清型的沙门菌引起的一类传染病，鸡沙门菌以鸡白痢沙门菌和肠炎沙门菌较常见，两者引起的鸡群发病症状非常相似，但肠炎沙门菌能够在禽类及其产品中稳定传播，其宿主比鸡白痢沙门菌更为广泛，是目前人类食物中毒的主要病原菌之一，这不仅影响养殖业的发展，还威胁人类健康。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型快速可靠的细菌鉴定方法[1]。操作快速简便、准确率高等特点，本试验应用MALDI-TOF-MS对河南地区规模化种鸡场致死鸡胚和肝脏中分离的41株疑似沙门菌进行鉴定，并用血清学方法进行比较，旨为兽医临床沙门菌的鉴定和防治提供一种方法和依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 河南地区规模化种鸡场疑似沙门菌致死鸡胚，鸡肝脏等。

1.2 主要仪器 MALDI Biotyper 高通量微生物鉴定系统，购自德国Bruker Dahonics公司，参数设置：线性操作模式，正离子，基质抑制偏转模式。脉冲离子提取时间：100 ns。相对分子质量：2 000～20 000 D；VITEK-2全自动细菌鉴定系统，购自法国生物梅里埃中国有限公司。

表1 41株疑似沙门菌血清学、MALDI-TOF-MS和VITEK-2鉴定结果比较

1.3 主要试剂 沙门诊断血清，购自宁波天润生物药业有限公司。

1.4 方法

1.4.1 生化鉴定 用比浊仪将所检测细菌浊度调整到0.5～0.63麦氏浊度范围内，利用VITEK-2中GN鉴定卡对沙门菌可疑菌株进行检测。

1.4.2 MOLDI-TOF-MS鉴定 挑取沙门菌显色培养基上的单个菌落(少量)，直接涂抹到MALDI靶板上，自然干燥后加1μL HCCA 基质液覆盖样品，室温晾干后放入质谱仪进行测量。打开FlexControl软件，采集数据图谱，通过Biotyper 软件进行分析鉴定。结果判断：使用MALDI Biotyper 3数据库进行数据比对，标准如下，得分为2.300～3.000完全可靠地鉴定到种的水平；得分为2.000～2.299可靠鉴定到属的水平，有可能鉴定到种的水平；得分为1.700～1.999有可能鉴定到属的水平；0.000～1.699，没有可信的鉴定结果。本研究均选取分值≥2.300的结果作为待测样本的鉴定结果。

1.4.3 血清学鉴定 按照GB4789.4-2010沙门菌检验的操作方法进行血清型的鉴定试验。

2 结果

2.1 MOLDI-TOF-MS鉴定结果 来源于河南各地种鸡场致死鸡胚和肝脏分离的41株疑似沙门菌株，经MALDI-TOF-MS鉴定，分别与沙门菌数据库进行比较，结果表明，41株疑似沙门菌的匹配分值均大于2.300，鉴定结果的可信度很高。

2.2 血清学、MALDI-TOF-MS和VITEK- 2鉴定结果比较 从表1可知,生化(VITEK)鉴定结果是沙门菌，其血清学和MALDI-TOF-MS鉴定结果是沙门菌。血清学鉴定结果是鸡白痢或鸡伤寒和布利丹沙门菌，MALDI-TOF-MS鉴定结果是肠炎沙门菌。而血清学鉴定是蒙得维的亚沙门菌和赛罗沙门菌，MALDI-TOF-MS鉴定结果是都柏林沙门菌和哈达尔沙门菌，说明血清学鉴定和MALDI-TOF-MS鉴定结果没有相关性。

3 分析与讨论

MALDI-TOF-MS能够准确快速的检测细菌体内生物大分子(蛋白质、多肽等)的分子量，它们具有种属特征，与细菌进化有关，因此可以作为细菌鉴定的重要手段[2]，传统细菌鉴定方法依据细菌的形态学和生理生化特性分析，不仅操作繁琐、耗时长，而且由于生化特性容易受培养基、保存时间等因素的影响，常常给鉴定带来困难。MALDI-TOF-MS具有操作简单快速、可自动化，结果准确等特点，使其成为细菌鉴定的新选择。采用MALDI-TOF-MS方法鉴定细菌的报道已有很多[3]，但针对兽医微生物的研究报道很少。本试验利用MALDI-TOF-MS对41株沙门菌株进行鉴定，操作方便、快捷快速、省时省力，同时对分离的不同菌株的指纹图谱进行比较，发现本试验分离的不同株沙门菌之间存在一定的差异。

本研究采集河南地区规模化种鸡场的致死鸡胚和鸡肝脏，经分离纯化后获得41株沙门菌，分别进行血清学鉴定、生化和MALDI-TOF-MS鉴定，结果表明3种鉴定方法均能鉴定出沙门菌，但对于血清分型结果和MALDI-TOF-MS分型结果没有相关性，该结论与之前(王晔茹 2008)报道的结果一致[4]。这是由于血清学特异性反应主要针对的是菌体表面的抗原决定簇，而MALDI-TOF-MS鉴定依据的是菌体内所有特异性的蛋白分子的指纹图谱，两者的数据差异明显。

肠炎沙门菌具有垂直传播的特点,能够在输卵管和卵黄里分离到,因此食用未完全加热至熟的蛋品可以导致人类食物中毒。虽然沙门菌对蛋类食品的污染率相对较小，却也能引起更大比例的食源性疾病暴发。而在鸡场的持续存在，使得养殖的过程中也很容易造成鸡群感染发病或鸡胚孵化失败，使鸡或鸡胚死亡，造成严重的经济损失，因此，有针对性地杀灭某些血清型沙门菌对控制鸡及其产品中沙门菌的污染有重要作用。

[1] Jadhav S, Bhave M, Palombo E A. Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes[J]. J Microbiol Methods, 2012,88(3): 327-341.

[2] 胡骁，林肖惠，佟巍，等.沙门菌MALDI-TOF MS 标准菌库的建立及应用研究[J].卫生研究，2014,43(1)：40-47.

[3] Santos C, Paterson R R, Venancio A,etal.Filamentous fungal characterizations by Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry[J].J Appl Mivrobiol,2010,108:375-385.

[4] 王晔茹，崔生辉， 李凤琴.基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱在沙门菌检测和鉴定分型中的应用研究[J].卫生研究，2008，37(6)：685-689.