核桃渣中单宁酸物质HPLC检测方法的建立

梁国伟 牟德华

1（中粮华夏长城葡萄酒有限公司，河北秦皇岛066600）2（河北科技大学，河北石家庄050018）

单宁酸物质是维管束植物常见的次生代谢产物，主要存在于叶、芽、种子，根和茎的组织。单宁酸物质具有抗菌活性，这使得植物可以抵御病菌的攻击，对草食动物也有影响。单宁酸可以使植物内的同化作用变得困难，同时产生一种难闻的味道。单宁酸因其对人类的健康有益而被大家知道，主要表现为一些生物学特性，包括抗诱变、抗癌和抗氧化的特性。有研究表明，单宁酸的抗氧化能力和它与铜离子螯合的能力有关。

核桃中的单宁酸种类有很多，而且不同品种核桃中单宁酸的种类和含量也不相同。研究表明，核桃内种皮中的单宁酸含量最高。本文以核桃乳生产过程中产生的废弃物核桃渣为原料，建立其单宁酸的HPLC检测方法，以期为核桃渣的综合利用提供基础依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标准品

酚酸类：咖啡酸，中国食品药品检定研究院；（+）-儿茶素，纯度≥94.4%，中国食品药品检定研究院；没食子酸，，纯度≥99.%，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；阿魏酸，纯度≥99%，生化试剂，天津市光复精细化工研究所。

类黄酮：无水槲皮素，纯度≥98%，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；芦丁，北京化学试剂公司。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈、冰乙酸，均为色谱纯；95%乙醇、乙酸乙酯、盐酸，均为分析纯；超纯水。

1.1.3 仪器

岛津LC-20AT系列高相液相色谱仪，Lc Solution Lite工作站，UV检测器，Inertsil ODS-SP反相C18柱（250 mm×4.6 mm）；旋转蒸发器。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的前处理

将核桃渣粉碎并去除油脂后，过40目筛，备用。

1.2.2 单宁酸的提取

称取1 g处理好的核桃渣，按照料液比1∶70，提取液为体积分数60%、pH1.5的乙醇溶液，提取温度70℃，提取时间60 min，超声波的功率是50 W。将提取液进行收集、离心、浓缩得到单宁酸的粗提液。后用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取相并氮吹至干，再用5 mL甲醇定容，用于HPLC测定。

2 色谱条件的优化

2.1 色谱条件选择

用2%冰乙酸和乙腈作为流动相分离单宁酸物质，通过改变流动相的配比以及浓度梯度，柱温达到各峰分离的目的。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系的考察

准确称取5 mg没食子酸、阿魏酸、（+）-儿茶素、咖啡酸、芦丁、无水槲皮素，溶于10 mL甲醇溶液中。将质量浓度为0.5 mg/mL的标准样品稀释成不同的浓度梯度。在已经确定的色谱条件下，进样量20 μL，进行HPLC分析。在测定的过程中根据需要及时调整浓度。根据液相色谱的峰面积与标准样品的进样量，确定线性回归方程、相关系数以及线性范围。

2.2.2 回收率考察

取已知质量浓度的单宁酸提取液加入一定量的各单体酚标准样品，在已经确定的色谱条件下进行HPLC测定，计算各组分的加标回收率。

加标回收率（%）=［实测值（mg）－样品中含量（mg）］/添加值（mg）×100%

2.2.3 精密度考察

日内精密度：在24 h内，将不同质量浓度的单宁酸标准品混合溶液多次进样进行测定，每次20 μL，根据峰面积计算日内RSD值。

日间精密度：取单宁酸标准品的混合溶液，在不同的日数内进行测定，计算日间RSD值。

2.2.4 稳定性考察

准确量取一定体积的单宁酸提取液，在室温下静置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h，根据已经确定的色谱条件进行HPLC测定，计算各单体酚峰面积的RSD值。

2.2.5 重复性考察

准确量取一定体积的单宁酸提取液，根据已经确定的色谱条件进行HPLC测定，计算各单体酚峰面积的RSD值。

2.2.6 最低检测限的考察

取一定质量浓度的标准样品混合溶液，用甲醇进行倍比稀释。以信噪比S/N=3为标准，测定该色谱条件下的最低检测量。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件

3.1.1 流动相的选择

分别选择1%冰乙酸-乙腈、1.5%冰乙酸-乙腈、2%冰乙酸-乙腈等不同的流动相进行检测，结果表明，2%冰乙酸-乙腈作为流动相时，各物质的分离度较好，峰形锐，故选择2%冰乙酸-乙腈作为流动相。

3.1.2 柱温的选择

柱温是影响物质分离的一个重要因素。分别考察了25℃、30℃、35℃、40℃等不同的温度对测定结果的影响。结果表明，30℃时各物质的分离度好，峰形锐，出峰时间适宜。故测定柱温选择30℃。

3.1.3 洗脱程序的确定

流动相A为2%冰乙酸，流动相B为乙腈（均过 0.45 μm有机膜），进样量 20 μL，流速 1 mL/min，柱温30℃，检测波长280 nm。梯度洗脱程序见表1。单宁酸标品色谱图见图1。

表1 单宁酸梯度洗脱程序

图1 单宁酸标品色谱图

3.2 定性分析

通过外标法进行定性分析，结果见表2。

表2 单体酚物质的定性分析

3.3 方法学验证

3.3.1 线性关系

以标准物质的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，计算各单体酚物质的标准曲线，线性范围及相关系数，结果见表3。通过表3的数据可以看出，标准物质的进样量和各物质的峰面积呈现良好的线性关系。

表3 单体酚的标准曲线回归方程、相关系数和线性范围

3.3.2 加标回收率

各单体酚物质的加标回收率试验结果见表4。由表4可以看出，各物质的加标回收率在80.66%～108.17%之间，因此该方法测定结果可靠。

表4 各单体酚物质的加标回收率

3.3.3 精密度

日内精密度和日间精密度的测定结果见表5。由表5可以看出，各多酚物质的峰变异系数均小于10%，故精密度良好，符合测定的要求。

表5 不同浓度混合标准品的日内和日间的RSD值

3.3.4 稳定性

各多酚物质的稳定性结果见表6。由表6可以看出，各单体酚物质的变异系数均小于10%，表明样品在24 h内稳定。

表6 多酚物质的稳定性RSD值

3.3.5 重复性

各多酚物质的重复性结果见表7。由表7可以看出，各单体酚物质的变异系数均小于10%，重现性良好，符合测定的要求。

表7 多酚物质的重复性RSD值

3.4 样品检测的结果

根据确定的色谱条件测得核桃渣中的单宁酸含量，结果见表8。由表8可知，核桃渣中含有没食子酸、儿茶素、咖啡酸、芦丁和槲皮素等多酚物质，阿魏酸未检出。其中没食子酸的含量最高，槲皮素的含量最低。

表8 核桃渣中多酚物质的含量

4 结论

以2%冰乙酸和乙腈为流动相，调整比例后进行洗脱，各单体酚物质的峰得到很好的分离。经过方法学的验证，各物质的线性关系良好，回收率在80.66%～108.17%之间。方法的精密度、稳定性和重现性良好，测定结果可靠。

核桃渣中多酚物质的含量均不同。核桃渣中含有没食子酸、咖啡酸、儿茶素、槲皮素和芦丁，其中没食子酸的含量最高，槲皮素的含量最低。

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