多功能净化平台在食品检测黄曲霉毒素B1中的应用研究

梁宝爱 张素娟 杨 凯

1（国家农副加工产品及白酒质量监督检验中心，山西太原030012）

2（山西省食品质量安全监督检验研究院，山西太原030012）

黄曲霉毒素B1是黄曲霉、寄生曲霉等产生的黄曲霉毒素次生代谢物之一，它被世界卫生组织划定为1类致癌物，毒性比砒霜大68倍，是目前已知霉菌毒素中毒性最强的，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物、肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。因此，我国的国家标准中对于各类食品中黄曲霉毒素B1的限量为 0.5 μg/kg～20 g/kg。

目前，黄曲霉毒素B1依据国家标准GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》进行检测，在样品前处理时，净化过程等仅提供了人工手动的前处理净化参考条件，耗时长、误差大，对检验人员身体健康存在安全风险。因此本研究采用多功能净化平台进行全自动提取净化处理,经高效液相色谱仪测定。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），韩国德山药品工业（株）；氯化钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯），天津市光复科技发展有限公司；氯化钾（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；吐温-20，天津市大茂化学试剂厂；盐酸（分析纯），北京化工厂；黄曲霉毒素B1标准溶液（3 μg/mL），美国 Supelco公司。

1.2 仪器与设备

Freedom EVO ppSPE型多功能净化平台，帝肯（上海）贸易有限公司；U3000高效液相色谱仪（荧光检测器），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；UGC-45CE型氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司；AL104型天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ5200DE型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；Pribolab型光化学柱后衍生器，青岛普瑞帮生物工程有限公司；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 净化条件

本研究“多功能净化平台”前处理方法与GB 5009.22—2016中“第三法 高效液相色谱—柱后衍生法”中前处理方法进行比较。

准确移取4 mL已处理好上清液（上清液的制备依据 GB 5009.22—2016中 12.1、12.2），加入46 mL1%吐温-20的PBS，混匀。

免疫亲和柱内的液体放弃后,采用多功能净化平台移取50.0 mL样品提取液，每次移取提取液2.5 mL，移取 20 次，以 17 μL/s（1 mL/min）的流速使溶液缓慢通过免疫亲和柱后，以空气吹扫体积3 300 μL过柱，移取10 mL水，以17 μL/s的淋洗速度淋洗柱子2次，弃去全部流出液，再以空气吹扫体积3 300 μL使空气通过柱体。准确移取2.0 mL甲醇洗脱，以17 μL/s的洗脱速度进行洗脱后，以空气吹扫体积2 000 μL排空亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s溶解残留物，用孔径0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

1.3.2 色谱条件

流动相：A相，水；B相，乙腈-甲醇（50+50）；等梯度洗脱条件：A，68%、B，32%；色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量：50 μL；光化学柱后衍生器；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱取样液量及各种流速的选择

使用多功能净化平台设备对流速的精确控制是自动化操作的最大优势，但若严格按照国标要求的流速进行过柱就会降低过柱的效率。依据多功能净化平台的实际流速控制范围 4.17 μL/s～4 167 μL/s，分别选取不同样品、不同浓度标准溶液，选取空气吹扫体积均为2 000 μL，对黄曲霉毒素B1检验项目取样量、固相萃取的净化液、淋洗液、洗脱液3种流速（8 μL/s、17 μL/s、35 μL/s）进行试验条件选择。

通过试验发现，在使用取样针进行移液时，为了对目标液体和系统液（水）进行有效隔离，防止二者接触后系统液对目标液体的稀释和污染，按国家标准方法要求，移取净化液体积、淋洗液体积分别为50 mL和20 mL。该多功能净化平台是5 mL的泵，能吸取目标液体的体积最大量为4 950 μL，只能通过多次循环移液来完成，而移液循环次数又是整数，因此，为了方便编程和修改程序，采用净化液体积每次吸取2.5 mL作为移液的最大体积进行循环。而对于淋洗液为水洗的步骤，使用系统液（水）进行，为了提高移液速度，在程序中就设置一次吸取5 mL，洗脱液吸取2 mL。

根据对5类食品中黄曲霉毒素B1检验加标回收率的情况（见表1）和检验时间结合确定最佳流速条件：黄曲霉毒素B1测定时样液、淋洗液、洗脱液流速控制在17 μL/s（相当于流速1 mL/min）。

2.2 进入固相萃取柱空气吹扫体积的选择

样液、淋洗液、洗脱液分别过柱后，均需要空气吹扫固相萃取柱。原因是第一步样液过柱完成后，如直接加入清洗液，柱子中残留的样本会降低清洗液的清洗效果，也降低样本中待测物与柱子的结合程度，会降低回收率。第二步淋洗液清洗完成后，如直接加入洗脱液，柱子中残留的清洗液会降低洗脱液的洗脱效果，降低洗脱效率，进而降低回收率的问题。第三步洗脱液过柱，目的是将被测物全部解析后，待分析。如不进行空气吹扫，就会直接影响检验结果的准确度。为了达到好的净化、洗脱效果，在选定多功能净化平台最佳流速参数的基础上，分别选取不同样品、不同浓度标准溶液，对黄曲霉毒素B1检验项目上样、淋洗、洗脱后选用3种空气吹扫体积（1 000 μL、2 000 μL、3 300 μL）进行最佳条件的选择。通过试验，根据5类食品中黄曲霉毒素B1检验回收率的情况（见表2），确定最佳空气吹扫体积：黄曲霉毒素B1检验项目上样后空气吹扫体积、淋洗后空气吹扫体积均为3 300 μL，淋洗后空气吹扫体积分别为 2 000 μL。通过空气吹扫体积的选择，既能将柱子中的残留液排干，又能提高各个过程的作用效率，从而能够达到很好的洗脱效果。

表1 黄曲霉毒素B1各流速参数的选择

表2 黄曲霉毒素B1过固相萃取柱空气吹扫体积的选择

2.3 多功能净化平台取样针及辅助设施的选择

多功能净化平台设备配备了约15 cm的长取样针和约11 cm的短取样针，根据配备的细试管，为了对待净化液样品准确移取，选择了长取样针进行净化试验，经过多次试验，发现在试验过程中经常出现取样针变形弯曲，在固相萃取柱上卡针、报警。为了解决报警、停止试验的情况，现选择了短取样针，同时对相应使用的试管和试管架进行了更换，样液试管采用了离心管，在连续进行试验过程中，未发生报警、卡针故障。

2.4 多功能净化平台净化步骤的选择

使用多功能净化平台设备处理样品，在样本量较大时，柱活化、上样顺序的选择尤为重要。在开始试验设定净化步骤程序时，对所有固相萃取柱进行活化，然后进行取样，但由于待净化液样液量较大，必须多次取样，同时考虑已活化的固相萃取柱不能变干。在一次固相抽取8个样液后，对取样针清洗，再取另一排的8个样液，由于交替取不同排的样液，增加了洗针的程序，增加很长的处理时间，同时增加了交叉污染的风险。通过不断试验，对于不能一次性取完样液的检验项目按一次性8个样品全部程序处理完，再进行下一排8个样品的处理。这样既减少了洗针次数，缩短了处理时间，又可使下一步的浓缩步骤提前进行。整个试验相当于缩短一半的时间，保证了准确性又提高了检验效率。

2.5 精密度的测定

根据样品基体的复杂程度和检验方法标准，选取了不同有代表性的4类食品样品，同时向部分阴性试样中加入一定浓度的标准溶液，按照1.3.1净化条件，进行精密度试验，平行测定6次，结果见表3。由表3可以看出，黄曲霉毒素B1检验项目加标量在 2.0 μg/kg～20 μg/kg范围时，相对标准偏差（RSD）在 1.45%～5.57%之间，符合 GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[5]中被测组分含量在0.1 μg/kg～10 mg/kg时，RSD为4.3%～7.5%的要求。

2.6 多功能净化平台稳定性试验

根据多功能净化平台设备具有8个独立的移液通道，可同时对8个样本进行过柱操作的特性，选取4种不同基质的空白样品，向试样中加入质量浓度5.0 μg/kg的标准溶液，提取后在多功能净化平台上进行自动化一次性净化处理，测定其含量，通过回收率的变化，确认多功能净化平台的稳定性，结果见表4。通过表4可看出，在进行每个检验项目测定不同基质的样品检测过程中回收率均在80%以上，变化不明显，稳定性良好。

2.7 准确度的测定

为了验证多功能净化平台前处理方法的准确度，选取不同基体的样品，加入不同质量浓度的各项目标准溶液，按照1.3.1净化条件，按已确定的净化条件进行处理，做准确度试验，结果见表5。由表5可以看出，黄曲霉毒素B1检验项目回收率在75%～105%之间，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中被测组分含量在＜0.1 mg/kg时，回收率范围在60%～120%的要求。

表3 同一样品加标准溶液或阳性样品进行精密度试验（n=6）

表4 8个独立移液通道同时测定不同样品加标准溶液进行稳定性试验

表5 同一样品加不同质量浓度标准溶液回收率试验结果（n=6）

2.8 与国标检验方法比较

2.8.1 检测数据的比较

为了验证该方法的可行性和可靠性，选取了不同具有代表性的样品，分别采用多功能净化平台与国家标准GB 5009.22-2016(第三法)手动固相萃取净化方法进行了比较，结果中见表6。由表6可知，2种方法均符合国家标准要求，但本方法回收率基本高于手动固相萃取净化方法，相对标准偏差低于手动固相萃取净化方法。结果表明，该方法的准确度高、精密度好、稳定性好，减少了人为引起的偶然误差。

表6 多功能净化平台与国家标准方法回收率及精密度的比较

2.8.2 工作效率的比较

通过多次试验，使用多功能净化平台进行净化处理的结果不仅准确度高、精密度好，而且从表7可看出，多功能净化平台的处理方法净化时间短，可节省3/4的时间，由原来的360 min中缩短到90 min。

多功能净化平台全自动方式进行净化处理，无需人员看守，检验人员可同时完成其他工作，从而提高工作效率；在保障检验人员安全方面，通过平台全自动进行净化处理，检验人员避免了直接接触阳性样品并减少了直接接触有机试剂的机会，从而使检验人员的身体安全得到了保障。

表7 多功能净化平台方法与国家标准方法的比较

2.9 多功能净化平台方法在实验室能力验证中的应用

2016年在参加食药总局和认监委对黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1的能力验证考核中，使用了多功能净化平台的净化处理方法对考核样品进行了试验，结果均为满意，充分证明该方法的可行性与可靠性。能力验证考核结果见表8。

表8 能力验证考核结果

3 结论

采用多功能净化平台建立了一种高效、准确、安全、环保的应用于食品中黄曲霉毒素B1检验的食品检验自动化净化前处理方法。试验结果表明，该方法回收率在81.3%～104.0%，RSD＜6.0%，准确度高、精密度好，能够满足其国家检验方法标准和GB/T27404—2008的要求。

［1］马志科，昝林森.黄曲霉毒素危害、检测方法及生物降解研究进展［J］.动物医学进展，2009，30（9）:91-94.

［2］余丹，邹成义.黄曲霉毒素对蛋品质影响及机理研究［J］.饲料工业，2009，30（4）：59-60.

［3］国家食品药品监督管理总局.GB2761—2017，食品安全国家标准食品中真菌毒素限量［S］.北京：中国标准出版社，2017：1-8.

［4］国家食品药品监督管理总局.GB 5009.22—2016，食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定［S］.北京：中国标准出版社，2016.

［5］中华人民共和国浙江出入境检验检疫局.GB/T 27404—2008，实验室质量控制规范食品理化检测［S］.北京：中国标准出版社，2008：3-27.