纤维素酶法提取黄秋葵多糖的工艺优化

孟 楠 樊振江 高雪丽

1（漯河食品职业学院，河南漯河462000）2（许昌学院，河南许昌461000）

黄秋葵（Okra,Hibiscus esculentus L.）别名羊角豆，为锦葵科秋葵属，是一年生药食同源植物，其果实可供食用，富含多种营养素，如蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等。近年来，国内外学者对秋葵已有研究，表明经常食用秋葵可提高人体免疫力、增强体质，是一种营养价值高、开发前景好的草本植物。

黄秋葵果实中富含多种营养素，营养价值和药用保健功能极高，具有广泛的应用前景。有研究表明，每100 g秋葵果实中约含蛋白质22.98 g，维生素C44 mg，磷65 mg，维生素B10.2 mg，维生素E 1.03 mg，镁 29 mg，维生素B20.2 mg，维生素PP 1.0 mg，铁 0.8 mg，脂肪 9.4 g，钾 95 mg，黄酮2.56 g，钙 45 mg。

现代药理学研究表明，秋葵具有多种生物活性成分，具有很高的药用价值。秋葵果实中特有的黏性物质可助消化，能有效治疗胃炎、保护肝脏和提高人体体质，其黏液亦可当做脂肪替代物使用，在巧克力和饼干制作中均有应用。此外，秋葵多糖还具有增稠、乳化等功效。Zheng Wei等对黄秋葵花中多糖成分进行了分离纯化，结果表明水溶性多糖组分可以有效抑制癌细胞增殖，且还有一定免疫调节功能，为进一步深入研究和应用秋葵多糖提供了依据。因此，秋葵多糖在食品行业具有良好的开发潜力和应用前景。

本文以黄秋葵果实为研究对象，采用纤维素酶法提取秋葵多糖，研究反应时间、反应温度、酶浓度、底物浓度对多糖提取率的影响，并在单因素试验的基础上，采用正交试验对黄秋葵果实多糖的提取工艺条件进行优化，旨在为秋葵多糖的工业化提取和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

黄秋葵，购自河南省漯河市丹尼斯超市。

1.2 仪器

UV-2550紫外分光光度计，日本岛津；DZF-6090真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水浴锅，北京长风仪器仪表公司；RE-2000E型旋转蒸发器，天津凯易达仪器有限公司；奥立龙pH计868型，上海热电仪器公司；SHZ（Ⅲ）循环水式真空泵和电热套，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺流程

秋葵→挑选清洗→打浆→酶法提取→减压浓缩→真空冷冻干燥→粗多糖

1.3.2 工艺要点

a）原料选择：要求秋葵新鲜，无虫蛀、无霉变。

b）打浆：以一定的料水比进行打浆，破碎秋葵，使提取更充分。

c）酶法提取：在不同提取温度、提取时间、酶浓度、底物浓度条件下进行提取秋葵多糖。

d）减压浓缩：将浸提液过滤，在真空度-0.06 MPa～0.08 MPa条件下进行浓缩至膏状。

e）真空冷冻干燥：真空冷冻干燥制备粗多糖。

1.3.3 秋葵多糖得率

秋葵多糖得率=提取物中多糖含量（g）/秋葵原料多糖含量（g）。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

采用苯酚-硫酸法测定秋葵多糖含量。分别配制质量浓度为 0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL的萄萄糖标准溶液，在490 nm处测其吸光度值。以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，见图1。回归方程为 y=9.768 9x-0.066 7（R2=0.994 6）。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 酶解反应的单因素试验

根据前期研究，本试验以中性纤维素酶为处理手段，分别研究提取时间、提取温度、酶浓度、底物浓度等因素对秋葵多糖得率的影响。

2.2.1 提取时间对秋葵多糖得率的影响

在固定的条件下，即底物浓度为10%(g/g)、酶浓度为0.3%(g/g)、提取温度为50℃及pH为6.0时，提取时间分别取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h进行试验，其试验结果见图2。

图2 提取时间对秋葵多糖得率的影响

从图2中可以看出，随着提取时间的延长，得率曲线趋于平稳，增加不明显。这可能是由于试验初始，酶浓度比较大，活性较高，能快速分解秋葵纤维组织，使秋葵多糖释放；随着时间的延长，酶不断被消耗，活性降低，反应接近停滞。考虑到经济实用性，确定适宜的反应时间为2 h。

2.2.2 提取温度对秋葵多糖得率的影响

在固定的条件下，即底物浓度为10%、酶浓度为0.3%、提取时间为1.5 h及pH为6.0时，分别选择提取温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行试验，试验结果如图3所示。

图3 提取温度对秋葵多糖得率的影响

由图3可知，在一定的作用时间里，当提取温度小于50℃时，秋葵多糖得率随着反应温度的增加而升高；当提取温度超过50℃时，秋葵多糖得率随着提取温度的增加而降低。这是因为在纤维素酶酶解过程中，温度对酶解反应效率的影响包括两个方面，即酶催化反应速度及酶的稳定性。在酶的最适温度以下，随着温度的升高，反应物的能量和分子间有效接触的频率增加，因而反应速度加快；超过最适温度，酶分子的空间结构由于能量的增加而发生改变，导致酶活性减弱或丧失，从而影响催化效果。由此，在温度50℃～60℃范围内，秋葵多糖具有较高的得率，可作为下一步正交优化试验的温度可选范围。

2.2.3 酶浓度对秋葵多糖得率的影响

在固定的条件下，即底物浓度为10%、提取温度为50℃、提取时间为1.5 h及pH为6.0时，分别选择纤维素酶酶浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%进行试验，研究其对秋葵多糖得率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，随着酶浓度的增加，秋葵多糖得率也逐渐增大。当酶浓度超过0.4%时，秋葵多糖的得率增加不明显，因此，确定酶的适宜浓度为0.4%。

2.2.4 底物浓度秋葵多糖得率的影响

在固定的条件下，即酶浓度为0.3%、提取温度为50℃、提取时间为1.5 h及pH为6.0时，分别选择底物浓度为5%、10%、15%、20%、25%进行试验，研究其对秋葵多糖得率的影响，结果如图5所示。

图4 酶浓度对秋葵多糖得率的影响

图5 底物浓度对秋葵多糖得率的影响

由图5可以看出，随着底物浓度的增加，秋葵多糖得率都逐渐增大，主要是因为底物浓度增加，反应速率增加。但当底物浓度超过达到一定值时，反应速率显著减小。

2.3 酶解反应的优化试验

由单因素试验可以得出酶解反应适宜作用条件：底物浓度为10%、酶浓度为0.4%、提取时间为1.5 h、提取温度为50℃及pH为6.0。为进一步得到酶解的较优条件，再进行L16（45）正交试验，因素水平设计见表1，正交试验结果见下页表2。

表1 因素水平设计表

由极差分析可知，各因素对秋葵多糖得率的影响大小顺序为：A＞C＞D＞B，即酶浓度＞底物浓度＞提取时间＞提取温度，最优组合为A4B4C3D3，即酶浓度为0.5%，提取时间为2.0 h，提取温度为60℃，底物浓度为10%。正交试验方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

由表3方差分析结果可知，在显著水平P=0.05时，酶浓度、底物浓度两因素都显著，由方差分析得出影响因素大小顺序为酶浓度、底物浓度、提取时间、提取温度，这和极差分析结果一致。

经验证试验，正交优化出的条件为：酶浓度0.5%，提取时间2.0 h，提取温度60℃，底物浓度10%，此工艺条件下秋葵多糖得率为81.06%。

3 结论

通过单因素试验和正交试验发现，影响秋葵多糖得率的4个因素的主次顺序为：酶浓度＞底物浓度＞提取时间＞提取温度，最优组合为A4B4C3D3，即酶浓度为0.5%，提取时间为2.0 h，提取温度为60℃，底物浓度为10%。经验证试验测得在最佳条件下秋葵多糖得率为81.06%。采用纤维素酶法提取秋葵多糖，具有高效、易操作，对环境污染小等优势。

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