长春瑞滨诱导人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3凋亡及降低端粒酶活性

申丽媛，徐冬梅*，刘潇涵，杨 玫，文亚玲

(1.重庆市妇幼保健院 妇产科，重庆 400021； 2.重庆医科大学附属第一医院 妇产科，重庆 400016)

研究论文

长春瑞滨诱导人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3凋亡及降低端粒酶活性

申丽媛1，徐冬梅1*，刘潇涵2，杨 玫1，文亚玲1

(1.重庆市妇幼保健院 妇产科，重庆 400021； 2.重庆医科大学附属第一医院 妇产科，重庆 400016)

目的探讨长春瑞滨对人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3细胞凋亡、端粒酶活性及亚单位人端粒酶反转酶mRNA(hTERT mRNA)表达的影响。方法将不同浓度的长春瑞滨作用于SKOV3细胞后，用CCK- 8法检测细胞增殖；流式细胞计量术检测细胞凋亡；端粒重复序列扩增酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性； RT-PCR检测细胞中hTERT mRNA表达。结果长春瑞滨可抑制SKOV3细胞增殖，诱导细胞凋亡(P<0.01)，降低SKOV3细胞中端粒酶活性及hTERT mRNA的表达(P<0.01)，且存在浓度-时间依赖关系。结论检测端粒酶的活性及hTERT mRNA表达，可能有助于判定长春瑞滨诱导上皮性卵巢癌细胞凋亡的敏感性。

上皮性卵巢癌；长春瑞滨；凋亡；端粒酶活性

目前，肿瘤细胞减灭术和联合化疗是中晚期卵巢癌的主要治疗策略，但因其广泛的盆腹腔转移，极大降低了手术的满意率，因此，发现有效的化疗药物具有重要意义[1]。长春瑞滨是第3代长春花碱类药物，在分子水平，它干扰细胞微管的动态平衡，与微管蛋白单体结合，抑制微管的形成，在有丝分裂中期阻断细胞活动，进而使细胞停滞在有丝分裂中期或使细胞死亡，为细胞周期特异性药物[2]。

端粒位于真核细胞染色体的末端，在维持染色体的稳定性、完整性和细胞活性有重要作用。端粒酶是由核苷酸和蛋白质组成的复合体，能延长缩短的端粒，从而增强细胞的增殖能力，hTERT是端粒酶的催化亚基，其表达情况与端粒酶的活性相关[3]。近年研究表明，多数化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡与端粒酶的活性有关[4]，长春瑞滨发挥抗癌作用的机制与端粒酶活性密切相关[5]，本实验观察长春瑞滨对人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3凋亡的诱导作用及对细胞端粒酶活性的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵巢癌细胞系SKOV3(中科院上海细胞库)；小牛血清(杭州四季青公司)；长春瑞滨(Pierre Farmos公司)；CCK- 8(上海生物公司)；Annexin V-FITC(凯基公司)；引物由上海生工合成，端粒酶活性检测试剂盒(武汉优尔生公司)；将10 mg长春瑞滨溶于0.9%氯化钠溶液，配成1 mmol/L液体，使用前稀释成所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理：取对数增殖期卵巢癌细胞SKOV3，实验设对照组、长春瑞滨组和调零组。对照组加入20 μL细胞培养液，长春瑞滨组加入等体积长春瑞滨药物，使其浓度为1、5和10 μg/mL，调零组加入与长春瑞滨组等量的PBS。

1.2.2 CCK- 8法检测细胞增殖：以1×104个/ mL细胞接种于96孔板中，每孔200 μL，各组均设5个复孔，分别在24、48及72 h取样，每孔加入CCK- 8 20 μL，37 ℃继续孵育，2 h后酶标仪检测吸光度(570 nm)，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率%=[1-(A给药组-A空白组)/(A阴性对照组-A空白组)]×100%，实验重复3次。

1.2.3 流式细胞计量术检测细胞凋亡：以5×105个/mL细胞接种于24孔板，分别在24、48及72 h用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集细胞，PBS洗涤2次，依次加入500 μL 结合缓冲液、5 μL Annexin V/FITC及5 μL PI溶液，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.4 端粒重复序列扩增酶联免疫吸附试验(TRAR-ELISA)检测端粒酶活性：收集各实验组细胞，用冷PBS洗涤2次，加入冰冷裂解缓冲液40 μL，4 ℃离心(600 r/min)，收集上清，按试剂盒说明进行PCR扩增实验。分别取阴性、阳性及待测样本各2.5 μL，加入变性剂10 μL，静置10 min后加入杂交缓冲液100 μL，吹打均匀，取100 μL混合液至亲和素包被的微孔板中，37 ℃中孵育2 h。洗涤3次后加入抗体100 μL，静置30 min，依次加入TMB显色液及终止液。酶标仪检测各孔在450 nm和690 nm处的吸光度值，依据公式：A=A450-A690计算端粒酶活性。

1.2.5 RT-PCR检测端粒酶hTERT mRNA水平：hTERT mRNA扩增引物序列：上游引物5′-CGGAAG AGTGTCTGGAGCAA-3′，下游引物5′-GGATGAAGCG GAGTCTGGA-3′。GAPDH作为内参照：上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物5′-CCTG GAAGATGGTGATGGGATT-3′。收集各实验组细胞，按Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。PCR扩增条件：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 长春瑞滨对卵巢癌细胞SKOV3的抑制作用

长春瑞滨可呈时间及剂量依赖性抑制SKOV3细胞增殖(图1)。

图1 长春瑞滨对卵巢癌细胞SKOV3增殖抑制的影响Fig 1 Inhibition of SKOV3 by different concentration of vinorelbine

2.2 长春瑞滨对细胞SKOV3凋亡的影响

长春瑞滨呈时间-浓度依赖性诱导SKOV3凋亡(表1)。

2.3 长春瑞滨对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响

1 μg/mL长春瑞滨作用48和72 h时，端粒酶活性明显降低(P<0.01)。5和10 μg/mL长春瑞滨作用24、48及72 h后，端粒酶活性相比对照组明显降低(P<0.01)(表2)。

表1 长春瑞滨对卵巢癌细胞SKOV3凋亡率的影响

*P<0.01 compared with control.

表2 长春瑞滨对卵巢癌细胞SKOV3端粒酶活性的影响

*P>0.05，**P<0.01 compared with control.

2.4 长春瑞滨对卵巢癌细胞hTERT mRNA的影响

长春瑞滨处理的卵巢癌细胞中hTERT mRNA表达随时间延长及浓度升高而降低(图2，表3)。

表3 长春瑞滨对卵巢癌细胞SKOV3 hTERTmRNA的影响

*P<0.01 compared with control.

3 讨论

端粒酶是一种特殊核糖蛋白复合体，可将端粒重复序列整合到染色体末端，具有维持肿瘤细胞永生化的能力[6]，抑制端粒酶的活性能够通过诱导细胞凋亡从而抑制肿瘤形成[7- 8]。因此，研究端粒酶的表达和活性及其在肿瘤细胞药物敏感性中的规律，为肿瘤的检测和治疗提供了新的临床思路。长春瑞滨针对复发和难治性上皮性卵巢癌有显著疗效[9- 10]。目前与长春瑞滨治疗上皮性卵巢癌相关的基础研究鲜有报道。

hTERT mRNA是调控端粒酶活性的关键因子，与细胞凋亡密切相关[11]。研究表明，hTERT与端粒酶活性具有一致性[12- 13]，本实验在不同时间用不同浓度的长春瑞滨作用SKOV3细胞后，发现长春瑞滨与SKOV3细胞的凋亡及增殖抑制作用呈时间-浓度效应关系。1 μg/mL长春瑞滨作用24 h即可显著下调上皮性卵巢癌细胞中hTERT mRNA的表达，然而端粒酶活性未见明显改变，1 μg/mL长春瑞滨作用48 h才见端粒酶活性的降低，5和10 μg/mL长春瑞滨在各时间点，均可见hTERT mRNA和端粒酶活性的下降，提示hTERT mRNA表达的改变比端粒酶活性更敏感，更有助于判定长春瑞滨治疗上皮性卵巢癌的疗效。

M.marker；1.control；2.1 μg/mL vinorelbine；3.5 μg/mL vinorelbine；4.10 μg/mL vinorelbine图2 1、5和10μg/mL长春瑞滨作用卵巢癌SKOV3细胞24、48和72 h时hTERT mRNA表达情况Fig 2 Expression of hTERT mRNA in SKOV3 by different concentration of vinorelbine in different time

端粒酶是目前较广泛、特异性强的肿瘤标志物，其活性与恶性肿瘤的生存预后显著相关，有报道端粒酶可能通过下调hTERT表达抑制其活性，从而诱导细胞凋亡[5]，与本研究结果相符。研究显示，hTERT mRNA和端粒酶在SKOV3细胞株及上皮性卵巢癌患者中显著高表达[14]，因此，通过检测患者病理性渗出物、血液及肿瘤脱落细胞等临床标本中hTERT mRNA表达和端粒酶活性，可能有助于上皮性卵巢癌的治疗疗效监测及预后的判断，亦可为上皮性卵巢癌的治疗提供新的靶点。

综上所述，长春瑞滨在SKOV3细胞中诱导细胞凋亡且下调hTERT的表达，其作用机制可能是通过下调hTERT mRNA抑制端粒酶活性，从而促使肿瘤细胞凋亡。与端粒酶活性相比较，hTERT表达更灵敏。因此，其可作为长春瑞滨治疗上皮性卵巢癌的理想监测指标，其具体作用机制待进一步研究。

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Vinorelbine induces apotosis and decreases telomerase activity in human epithelial ovarian cancer cells line SKOV3

SHEN Li-yuan1, XU Dong-mei1*, LIU Xiao-han2, YANG Mei1, WEN Ya-ling1

(1.Dept. of Gynaecology and Obstetrics，Chongqing Health Cencer for Women and Children, Chongqing 400021;2.the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations of vinorelbine on apoptosis,telomerase activity and expression of human telomerase-reverse transcriptase gene (hTERT) in human epithelial ovarian cancer cells SKOV3.MethodsOvarian cancer cells SKOV3 were treated with vinorelbine under different concentrations. The cell proliferation was measured by cell counting kit- 8 (CCK- 8) assay, and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. The telomerase activity of SKOV3 cells was determined by TRAP-PAGE-silver staining; The mRNA expression of hTERT was performed by RT-PCR assay.ResultsVinorelbine could significantly inhibited the proliferation of SKOV3 cells,induce cell apoptosis(P<0.01)，reduce the telomerase activity and expression of hTERT mRNA(P<0.01), in dependent of a concentration-time manner.ConclusionsThe detection of telomerase activity and the mRNA expression of hTERT might be vital for predicting the prognosis of patients with epithelial ovarian cancer.

epithelial ovarian cancer; vinorelbine; apotosis；telomerase activity

2017- 08- 24

2017- 11- 17

*通信作者(correspondingauthor)：76548265@qq.com

1001-6325(2018)01-0087-04

R711.75

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