花生半矮化突变体sdm1的表型分析与赤霉素响应研究

李欢倪+仇静静+马俊杰+李长生+侯蕾

摘要：本研究利用快中子辐照花生山花13号的干种子，获得了一个性状稳定遗传的花生半矮化突变体sdm1（semi-dwarf mutant 1），继而对其矮化形态、经济性状指标及赤霉素响应特性进行了分析。结果表明，与山花13号相比，该突变体植株半矮化、枝较粗，种仁较大、种皮色泽较深，种子成分中含油量提高、粗蛋白含量下降。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定了突变体叶片中赤霉素的含量，发现突变体赤霉素含量明显低于山花13號，用 GA3处理突变体能够恢复突变体的株高。利用qRT-PCR方法分析赤霉素代谢和信号传导途径相关基因的转录水平，发现AhGA2ox、AhGA3ox、AhGA20ox、AhDella2、AhDella3等基因的表达均发生明显变化。以上结果表明，突变体内赤霉素合成途径关键酶基因的表达水平发生变化，使赤霉素合成能力下降，导致植株内赤霉素水平降低，从而出现矮化表型。

关键词：花生；半矮化；突变体；赤霉素；基因表达

中图分类号：S565.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0001-05

Abstract One semi-dwarf mutant sdm1 with stable inheritance was isolated from peanut cultivar Shanhua 13 induced by fast neutron irradiation. Its dwarf morphology， economic traits and response to gibberellin were analyzed. The results showed that compared with Shanhua 13， sdm1 showed semi-dwarf in plant height， thicker branches， larger seeds and darker seed coat color. The seed oil content of the mutant was increased and the protein content was decreased. The GA3 content in the leaves of sdm1 mutant was determined using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and we found that its gibberellin content was significantly lower than that in Shanhua 13. Treated with exogenous GA3 could restore the dwarf phenotype of mutant. The qRT-PCR was used to analyze the transcriptional level of genes related to GA biosynthesis pathway and signal transduction pathway， and the results showed that the expression level of AhGA2ox， AhGA3ox， AhGA20ox， AhDella2 and AhDella3 changed significantly. The changed expression of these key enzyme genes led to the decrease of gibberellin content in mutant plants and caused dwarf phenotype.

Keywords Peanut； Semi-dwarf； Mutant； Gibberellins； Gene expression

矮化突变体是改善作物株型、培育抗倒高产新品种的基础，也是鉴定植物矮化基因、研究株型调控分子机理的重要材料。然而，极端矮化往往会导致植物生物量下降，产量降低；而半矮化是一种优良的农艺性状，可在保证产量的前提下改善植物株型，减少生产过程中的化控，降低药剂使用对环境的污染，同时也减少了人工成本。创建优良株型，可通过改善种植密度使个体和群体协调发展，提高光能和土地资源利用率，从而提高作物产量[1]。

植物激素合成或信号传导通路上的基因发生突变往往会造成植株矮化。赤霉素（gibberellins，GAs）与植物植株高矮密切相关，在植物的生长和发育过程中起着重要的调节作用，如促进茎伸长、叶片延展、促进种子发育和诱导种子萌发等过程。赤霉素合成和信号传导途径关键基因的突变产生了水稻半矮秆突变体，这些突变体在肥水充足的条件下植株生长正常，降低了因营养生长过度造成倒伏的可能性，从而获得高产[2]。20世纪60—70年代，多个国家大面积推广利用水稻、小麦等半矮化品种，大幅度提高了粮食产量。张达等[3]用NaN3处理大豆获得了矮化突变体东泽11号，检测植物体内GA3含量发现，突变体不同生育期的赤霉素含量都低于对照材料。胡召杉等[4]研究了四倍体矮秆小麦拔节期赤霉素合成途径中的关键酶基因及其与植株矮化的关系，发现赤霉素合成通路关键基因GA20ox和调控因子GA-MYB等的低水平表达影响了小麦拔节期赤霉素的合成，从而导致矮化性状的产生。

花生（Arachis hypogaea L.）是我国最重要的油料作物之一，在国民食品安全和进出口贸易中占据重要位置。在一个生长季内，为防止花生植株生长过旺，一般要喷施两次多效唑、烯效唑等生长抑制物质，不仅增加生产成本，同时也对环境和食品安全造成影响。本研究利用快中子辐照山花13号干种子，从M2代筛选到一个半矮化突变体，从农艺性状、经济性状和植株对赤霉素的响应等方面对其进行分析，为阐明产生该突变性状的分子机理以及进一步利用该突变体培育花生新品种奠定了基础。endprint

1 材料与方法

1.1 研究材料

用于选育突变体的原始材料为生产上广泛种植的花生优良品种山花13号，用辐照能量为14.0 MeV、辐照剂量为14.0 Gy的快中子射线辐照花生干种子。辐照处理在中国原子能科学研究院进行，材料由山东省农业科学院生物技术研究中心保存。

2015年5月初在大田播种花生突变体库M2代种子，当年7月份从中筛选到一个株系出现株高正常和半矮化的表型分离。2016年4月下旬将该突变体M3代种子单株播种，观察每个株系的表型并记录。2017年4月25日将对照山花13号与M4代突变体花生种子种植在山东省农业科学院生物技术研究中心试验基地，株距20 cm，行距50 cm，单粒播种。

1.2 试验方法

1.2.1 花生半矮化突变体的表型分析 播种130 d后收获花生，对其株高、侧枝长、主茎节数等农艺性状进行测定，并对单株结果数、饱果率、双仁果率、百果重、百仁重和出仁率等经济性状进行分析。

1.2.2 种子营养成分含量测定 利用定氮仪、气象色谱仪对花生种子粗蛋白、脂肪酸含量等进行检测，以未诱变山花13号为对照进行比较。该试验在中国科学院油料研究所完成。

1.2.3 内源赤霉素含量测定 对大田生长90 d的成熟期花生叶片进行取样，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定内源赤霉素的含量。

1.2.4 赤霉素处理 试验在温棚内进行。赤霉素处理组与水处理对照组的突变体与山花13号分别种植在两个小区。小区行长3 m，行距50 cm，株距20 cm。肥水管理措施同一般大田。于出苗后30 d开始处理，选取长势一致的植株，以50 mg/L GA3溶液为处理液，每天下午用喷壶喷施1次，使处理液充分而均匀地分布于整个植株表面，对照组喷水，连续喷施30 d。分别于处理前、处理30 d时对植株高度进行测定。

1.2.5 qRT-PCR法检测基因表达水平 取生长90 d的花生叶片，提取RNA之后用DNaseⅠ降解残存的DNA，以反转录的cDNA为模板进行qRT-PCR，检测相关基因表达水平，以组成型表达的花生AhActin 基因作为内参。qRT-PCR采用FastStart SYBR Green 试剂盒（Roche）按说明书进行操作。PCR反应程序及计算方法参照王成祥等[5]所述方法。引物名称及序列见表1。

2 结果与分析

2.1 半矮化突变体sdm1的筛选

从M2代开始，在大田单粒播种花生突变体库种子，并对特異表型植株进行筛选，发现其中一个株系在M2代出现株高正常和半矮化的表型分离。故从M2代开始，连续播种该株系3个世代，并对其单株表型遗传性进行分析。发现在M2代呈现半矮化性状的植株后代全为半矮化植株，到M4代仍可稳定遗传；而在M2代表型正常的植株其后代出现正常植株和半矮化植株的分离。该株系即为性状稳定遗传的半矮化花生突变体，将其命名为sdm1（semi-dwarf mutant 1）。

2.2 半矮化突变体sdm1的植株生长特性分析

从图1A看出，与山花13号相比，半矮化花生突变体sdm1最明显的表型是株高变矮。收获期时突变体sdm1的主茎高为42.34 cm，而山花13号主茎高为62.95 cm，株高降低32.7%（图1B）。另外，突变体还表现出茎节间长度变短、枝变粗、种仁略大、种皮色泽较深等（图1A、C）。突变体植株直立，不易倒伏，叶片则与山花13号无明显差异。山花13号和sdm1突变体的全生育期日数接近，在本试验条件下均在130 d左右。

于收获期对sdm1突变体与山花13 号进行部分农艺性状的调查（表2），对比发现，sdm1的侧枝长明显低于山花13号，sdm1的平均侧枝长为57.85 cm，山花13号为91.42 cm；sdm1的分枝数明显高于山花13号，其中sdm1的平均分枝数为14.12个，山花13号为9.80个；主茎节数无明显差异；突变体sdm1的果针数则多于山花13号。

从影响产量构成的单株生产力、饱果率、双仁果率、百果重、百仁重和出仁率等经济性状（表3）来看，突变体sdm1的单株结果数、单株生产力、饱果率、双仁果百果重和百仁重均高于对照品种，如突变体sdm1的单株结果数为39.16个，而山花13号是31.05个，平均每个单株比对照多结8.11个果；突变体sdm1的单株生产力为53.58 g，而山花13号是47.01 g，平均每个单株比对照增产13.98%。而幼果数和秕果率均低于对照品种，突变体sdm1分别是10.36和11.03%，山花13号分别是14.31和12.92%。突变体sdm1双仁果率为57.96%，比山花13号双仁果率（77.84%）低约20个百分点。两个品系之间出仁率则没有明显差异。

2.3 半矮化突变体sdm1的种子营养成分分析

对突变体和对照品种的种子粗蛋白、含油量、脂肪酸等成分含量进行测定（表4），结果发现突变体含油量升高，为57.35%，比山花13号高10.0%；粗蛋白含量则明显降低，比山花13号低20.6%。脂肪酸成分中，棕榈酸、棕榈一烯酸、硬脂酸、花生酸的含量略有上升，而十七碳烷酸、十七碳一烯酸、油酸、亚油酸、花生一烯酸、山嵛酸、二十四碳烷酸的含量均下降。

2.4 半矮化突变体的内源赤霉素含量测定

对成熟期sdm1突变体和山花13号内源赤霉素含量进行测定，发现突变体中GA1/3和GA4/7赤霉素含量均下降（图2）， sdm1突变体的内源GA1/3含量（4.68 ng/gFW）明显低于山花13号的6.02 ng/gFW；同样， sdm1突变体的内源GA4/7含量（4.28 ng/gFW）也低于山花13号的5.57 ng/gFW。因此，sdm1突变体的内源赤霉素含量减少可能是其植株矮化的关键原因。endprint

2.5 赤霉素处理对半矮化突变体株高的影响

为检测赤霉素对半矮化突变体sdm1植株高度的影响，我们利用外施GA3的方法对sdm1突变体和山花13号进行处理。从图3看出，出苗30 d时，sdm1突变体株高比山花13号矮，但差异较小。而生长60 d时，对照组sdm1突变体比对照品种明显矮小，株高大约是山花13号的79%；而外施赤霉素GA3处理组，突变体的株高较对照略矮，但差异不显著，说明赤霉素能够恢复突变体的株高。

2.6 赤霉素合成代谢与信号传导通路相关基因的表达分析

通过qRT-PCR方法检测了半矮化突变体和山花13号中与赤霉素合成和信号传导通路相关基因的表达情况（图4）。AhGA2ox、AhGA3ox和AhGA20ox是赤霉素合成途径中的关键酶基因，结果显示，突变体中AhGA2ox、AhGA3ox的表达水平与对照比明显升高，分别是山花13号的2.76、1.54倍，而AhGA20ox的表达降低，是对照的65%。DELLA蛋白是赤霉素信号传导途径中关键的负调控因子，结果表明，AhDella1、AhDella2两个基因的表达略微升高，升高倍数分别为1.14、1.78，而AhDella3的表达升高显著，在突变体sdm1中的表达量是对照中的6.6倍。

3 讨论与结论

植株徒长、倒伏是导致花生减产的突出问题。花生化控技术是在盛花后期至结荚前期的生长最旺盛时期，为避免植株徒长，通过叶面喷施多效唑、烯效唑等植物生长调节剂来控制花生植株高度，防止倒伏[6]。山花13号的高产栽培技术需在花生植株高度达到35～45 cm时进行化控，一般要化控两次[7]，不仅对环境造成污染，且增加人工成本。而在半矮化材料的栽培过程中不需化控，从而降低化学药剂对环境的污染，减少投入。因此，筛选半矮化花生突变体材料具有重要意义。本研究筛选的半矮化花生突变体sdm1主茎高降低，经济性状指标升高，在改善植物株型的同时可提高花生产量和含油量。该材料在花生生产中应用能有效减少化控，降低人工成本，增加经济收益。

经ELISA检测赤霉素的含量发现，半矮化花生突变体sdm1的内源赤霉素含量明显减少，而苗期喷施赤霉素能使突变体株高恢复至正常水平，由此推断突变影响了花生赤霉素的合成从而导致植株矮化。

植物体内赤霉素的生物合成是一个多步骤多种酶参与的过程。GA20ox是赤霉素生物合成最重要的限速酶，GA12、GA53分别在GA20ox的连续氧化后脱去CO2生成GA9和GA20，然后GA9和GA20在GA3氧化酶（GA3ox）的催化下，经过3β-羟基化生成具有生物活性的GA4和GA1[8]，过量表达GA20ox，植物会表现出叶片变淡、节间伸长的生理性状[9]。GA20ox是在赤霉素合成途径中起负调控作用的一种关键酶，通过2β-羟基化反应催化有生物活性的赤霉素或它的前体失活。在拟南芥中过量表达GA2ox可以使植株出现矮化，使开花时间延长，影响种子的育性等[10]。本研究利用qRT-PCR 方法检测了突变体中AhGA2ox、AhGA3ox和AhGA20ox基因的表达水平变化，结果表明，相对于对照栽培种山花13号，突变体sdm1中AhGA20ox的表达明显降低，而AhGA2ox表达量升高1.76倍，推测AhGA20ox和AhGA2ox基因表达水平的变化是赤霉素含量降低的主要原因，这与矮秆小麦中的研究结果类似[4]。GAI是赤霉素信号途径负调控因子DELLA家族的成员之一，GAI基因的表达在小麦矮秆突变体ANW16F、ANW16G和矮秆番麦中的表达量显著高于高秆品种[11]。本研究得到了类似的结果，AhDella2和AhDella3的表达量在半矮化突变体中均上升，尤其AhDella3的表达量是对照的6.6倍。本试验结果表明，半矮化突变体中赤霉素合成和信号传导途径关键基因的表达水平发生变化，导致植株中赤霉素含量降低和突变体植株矮化。

参 考 文 献：

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