拟南芥耐硒突变体的鉴定及基因定位

陈大清+钟育海+李应生

摘要：在硒盐胁迫下通过根弯曲特性筛选获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）耐硒突变体，并以突变体为母本与野生型（Ler）杂交获得基因型完全杂合的F1代；自交产生的F2代硒敏感，硒耐受的分离比为3∶1，表明该突变体是隐性单基因遗传。F2代选出132株具有耐硒特性的植株作为图位克隆的群体，从应用SSLP和In/Del分子标记进行基因定位，通过分析目的基因与各分子标记之间的连锁关系，发现耐硒突变体基因位于第I号染色体F12P19和NGA111的分子标记之间。

关键词：拟南芥（Arabidopsis thaliana）；硒盐胁迫；突变体；基因定位

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）02-0115-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.029

Abstract： A selenate-torlerance arabidopsis mutant was obtained by using the root-bending trait under selenate stress. It was conformed that the selenate resistant characteristics could be steady inheritance. Then this mutant was crossed with the wild-type Ler. and F1 generation were created with heterozygous type completely. The F2 crossed by theirself were expressed the separation ratio of 3∶1 in response of sensitive selenium to resistent selenium，It were suggested that this mutant was a monogenic recessive mutation. Map-based cloning population were composed of the 132 selenate-tolerance seedlings in F2 generation. Using SSLP and In/Del based on PCR to preliminary chromosomal location. Through linkage analysis，it's indicated that this mutant gene was located on the chromosome I，which was mapped between molecular marker F12P19 and NGA111.

Key words： Arabidopsis thaliana； selenate stress； mutant； gene lacation

微量元素硒（Se）不仅是人、动物和微生物的必需营养元素，也是植物生长发育的有益元素[1，2]。植物中的硒含量从每千克干重数微克到数克[3]，为研究植物硒代谢提供了潜在的遗传资源。关于植物硒代谢与积累已有许多学者从不同方面进行系统评述[4-8]。硒耐受关联突变体通过T-DNA插入法，结合应用拟南芥基因组序列的分析，分离到了mmt突变体[9]，从拟南芥中获得了由于硫转运体基因损害的突变体[10]。Zhang等[11，12]发现不同生态型拟南芥之间存在硒的耐受性差异，通过数量性状作图分析确定了拟南芥中不同染色体上的硒耐受相关遗传位点。19种拟南芥材料的硒耐受和积累的变异已经鉴定[13]。据分析，在拟南芥中参与硫的吸收与转运的基因家族至少有14个[14]。Kassis等[15]通过筛选T-DNA插入突变体库获得了硫转运体基因（SULTR1；2）功能缺失但却耐硒的变异株（sel1-11）。Tamaoki等[16]测定了Columbia（Col-0）和Wassilewskija（Ws-2）的对亚硒酸盐的耐受指数，依据芯片和半定量PCR分析比较了二者对硒耐受的生理和分子响应机理的差异。Zhao等[17]应用水稻硅转运体突变体材料研究发现硅的内流转运体（OsNIP2；1）与亚硒酸盐的渗透吸收相关联，这是迄今在植物中首次鉴定出的亚硒酸盐转运体。植物耐硒相关的突变体主要是硫转运体基因功能缺失（损伤）或某些硒同化代谢关键酶基因的插入失活所致，但涉及亚硒酸盐耐受突变体仍然少见。由于硒代谢积累的复杂性，创造和利用新的突变体和芯片分析及基因组学分析是揭示其机理的有效途径。中国的硒分布不平衡，开发利用富硒资源具有必要性和迫切性，但富硒强化食品开发极需从代谢机制上进行科学阐释和规范，加强对植物硒代谢积累的研究对指导食品硒营养的分子改良具有重要理论和实践意义。此外耐硒功能基因的开发将有助于培育超富集硒的转基因速生植物，为环境硒污染植物治理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia和Landsberg生态型；突变体通过EMS诱导，在亚硒酸盐胁迫下，对100多万粒诱变种子通过根弯曲特征鉴定篩选出的耐硒突变株。

1.2 突变体耐受稳定性试验

将培养皿中培养5～6 d的幼苗（根长约1.0～1.5 cm）从培养室中取出，揭开皿盖，用小钝头镊轻轻夹住一片子叶，小心地将生长于平板上的幼苗抽出，避免伤及下胚轴和根。然后将突变体和野生型的幼苗分别转移至含Na2SeO4选择培养基中，于培养架上倒置垂直培养。第6天观察根弯曲程度并测量根负向地性生长量，统计并计算其平均值，评估突变体的耐硒特性，连续培养到M5代。endprint

1.3 突变体的遗传特性

在Na2SeO4选择培养基上通过根弯曲试验分别鉴定F1和F2代的根弯曲情况，统计分析F2代的分离比。

1.4 突变体耐硒基因的定位

采用F1自交产生的F2为作图群体。F2代于38 mg/L的Na2SeO4选择培养基筛选，出现性状分离，将带有耐硒目的基因纯合植株挑选出来后移植到蛭石中培养；20 d后，用挑选出来的突变体叶片提取基因组DNA（CTAB法）。参考（www.arabidopsis.org），选择了20个SSLP分子标记，使其按间距为20-35 cM平均分布于拟南芥5条染色体上，同时利用数据库和软件设计In/Del分子标记引物，用于进一步连锁分析。

2 结果与分析

2.1 M3代根弯曲特性比较

从表1可以看出，以野生型Col-0根负向地性生长量指标为参照，M3代12个株系中M3-6、M3-11硒耐受性不明显；M3-12达到显著水平，表现为硒耐受性；M3-5、M3-9、M3-10、M3-4、M3-1、M3-3、M3-2、M3-7、M3-8都达到了极显著水平，且根负向地性生长量平均值较高，远远高于野生型，耐硒特性十分明显。其中M3-8株系根负向地性生长量最高（7.94 mm），是野生型的2.13倍，同时，M3-8株系植株的根弯曲均一，选取根弯曲程度最明显的植株M3-8-4、M3-8-5、M3-8-11、M3-8-14自交繁殖（图1），至种子成熟后单株收种，作为进一步检验的材料。

在此基礎上连续进行M4、M5代的耐硒稳定性比较（结果未列出），表明M3-8株系是能稳定遗传的耐硒突变体，适合开展基因定位工作。

2.2 突变体显隐性分析

图2所示为突变体与Landsberg杂交后的F1代，图3显示为F1代和Col-0、Ler的基因组DNA经特异引物扩增后的电泳检测结果，表明基因型为杂合型，说明杂交是成功的，可以继续用于遗传规律分析[2]。

将收获的F2代种子在含38 mg/L的Na2SeO4选择培养基上测试其表现型，在观察的580株F2代群体中，对硒耐受的敏感型和不敏感型分离比接近 3∶1。用χ2对其分离比做适合性测验见表2，符合孟德尔遗传规律，可以初步判断该突变体是由隐性单基因控制。

从图4可以看出，在被检测的群体中，大部分为C带型，少数样品表现为H带型和L带型。由于在突变位点附近，大部分的突变体都没有发生交换，因此突变位点附近的分子标记与突变体遗传背景一致的原始亲本Col-0连锁，PCR电泳的带型与Col-0一样，都为C带型[3]。而其他非突变位点，突变体大部分都发生了交换，在该位点上表现出既有Ler野生型，又有Col-0野生型的特征，表现为电泳结果就是C和L两条带（杂合带）。由此推测该突变基因与NGA280分子标记可能存在连锁关系。

在NGA280上、下游分别寻找分子标记位点，根据NGA280和NGA111对132个作图群体的扩增结果判断，发现NGA111与突变基因之间之紧密连锁，突变基因的物理位置应位于这两个分子标记之间，且靠近NGA111，检测指向NGA280下游的F12P19（位置：94.50 cM），同样对132个作图群体进行了PCR扩增检测统计分离比例，其重组率为12.12%。NGA63、NGA280、F12P19和NGA111 4个分子标记在第I号染色体的位置分别为11.48、83.83、94.50和115.55 cM（表3）。在NGA280、F12P19和NGA111 3个分子标记的扩增结果中，有些个体表现为杂合型（H），少数个体表现非原始亲本的型（L），大多数个体为原始亲本型（C），提示突变基因与这些分子标记的连锁较为紧密。但NGA63的重组率接近50%，与突变位点的遗传距离相对较远，因此可以初步判断突变基因位于拟南芥第I号染色体上，与分子标记F12P19和NGA111紧密连锁（图5、表3）。

3 讨论

突变体（M3-8）繁殖自交后代均表现出硒耐受性，检测到M5代也表现稳定系耐受特性，表明该突变性状能够稳定遗传。突变体和野生型Ler杂交，F1代表现为硒敏感性，F2代野生型和突变体的性状分离比为3∶1，提示该突变是单基因隐性突变。这样可以直接从子二代中选出纯合的突变体，利用F2中纯合的突变体构成作图群体，开展基因定位克隆。NCBI和Tair数据库搜寻结果显示，登录拟南芥第I号染色体的硒关联基因分别是SULTR1；2（At1g78000）、AtCpNifS（At1g08490、APR2（At1g62180）、SAT5（At1g

55920）、APS2（At1g19920）和CGS（At1g33320）等。筛选的突变基因位于拟南芥的第I号染色体的分子标记F12P19和NGA111之间（95～115 cM），在此区间尚未发现耐硒关联基因的报道，提示该耐硒突变体可能是一个新的硒耐受基因，开展基因克隆和关联功能分析具有理论和实践意义。

参考文献：

[1] ELLIS D R，SALT D E.Plants，selenium and human health[J].Current Opinion in Plant Biology，2003，6（3）：273-279.

[2] BIRRINGER M，PILAWA S，FLOHE L.Trends in selenium biochemistry[J].Cheminform，2003，34（14）：693-718.

[3] BROWN T A，SHIFT A.Selenium：Toxicity and tolerance in higher plants[J].Biological Reviews，2010，57（1）：59-84.endprint

[4] 陳大清.植物硒同化的研究进展及其耐硒突变体的筛选[J].氨基酸和生物资源，2004，26（2）：65-70.

[5] SHRIFT A.Aspects of selenium metabolism in higher plants[J].Annu Rev Plant Physiol，1969，20（1）：475-494.

[6] TERRY N，ZAYED A M，SOUZA M P D，et al. Selenium in higher plants[J].Annu Rev Plant Physiol，2000，51：401-432.

[7] SORS T G，ELLIS D R，SALT D E. Selenium uptake，translocation，assimilation and metabolic fatein plants[J].Photosynth Res，2005，86（3）：373-389.

[8] WHANGER P D. Selenocompounds in plants and animals and their biological significanc[J].Journal of American College of Nutrition，2002，21（3）：223-232.

[9] TAGMOUNT A，BERKEN A，TERRY N，et al.An essential role of S-Adenosyl-L Methionine：L-Methionine S-Methyltransferase in selenium volatilization by plants. Methylation of Tagmount A，Berken A，Terry N，et al，An essential role of S-Adenosyl-L Methionine：L-Methionine S-Methyltransferase in selenium volatilization by plants. Methylation of selenomethionine to selenium-Methyl-L-Selenium-Methionine，the precursor of volatile selenium[J].Plant Physiol，2002，130（2）：847-856.

[10] SHIBAGAKI N，ROSE A，MCDERMOTT J P，et al. McDermott JP，et al.Selenate-resistant mutants of Arabidopsis thaliana identify sultr1；2，a sulfate transporter required for efficient transport of sulfate into roots[J].Plant J，2002，29（4）：475-486.

[11] ZHANG L H，ABDELGHANY S E，FREEMAN J L，et al. Investigation of selenate tolerance mechanisms in Arabidopsis thaliana[J].Physiol Plant，2006，128（2）：212-223.

[12] ZHANG L，BYRNE P F.Mapping quantitative trait loci associated with selenate tolerance in Arabidopsis thaliana[J].New Phytol，2006，170（1）：33-42.

[13] ZHANG L，ACKLEY A R，PILON-SMITS E A H. Variation in selenium tolerance and accumulation among 19 Arabidopsis thaliana accessions[J].Plant Physiol，2007，164（3）：327-336.

[14] BUCHNER P，TAKAHASHI H，HAWKESFORD M J.Plant sulphate transporters coordination of uptake，intracellular and long-distance transport[J].Journal Experimental Botany，2004， 55（404）：1765-1773.

[15] KASSIS E E，CATHALA N，ROUACHED H，et al.Characterization of a selenate-resistant Arabidopsis mutant.Root Growth as a Potential Target for Selenate Toxicity[J].Plant Physiology，2007，143（3）：1231-1241.

[16] TAMAOKI M，FREEMAN J L，PILON-SMITS E A H. Cooperative ethylene and jasmonic acid signaling regulates selenite resistance in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2008，146（3）：1219-1230.

[17] ZHAO X Q，MITANI N，YAMAJI N，et al. Involvement of silicon influx transporter OsNIP2；1in selenite uptake in Rice[J].Plant Physiology，2010，153（4）：1871-1877.endprint