入境旅客携带苹果中粉红聚端孢菌的检测与鉴定

许萍萍+粟寒+王振华

摘要：首次建立了粉红聚端孢菌（Trichothecium roseum）实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法扩增效率高、特异性好，灵敏度可达0.1 pg菌丝体DNA量；结合形态学观察及致病性测定，对从机场入境旅客携带的苹果中分离到的1株疑似菌株Tr-1685进行检测和鉴定。Tr-1685实时荧光PCR检测结果为阳性。该菌株在PDA培养基上生长较快，菌落平展，边缘不规则，表面形成淡粉红色的霉层，产孢量丰富。分生孢子梗直立，长短不一，顶端着生分生孢子。分生孢子双细胞、光滑、棍棒状，平均大小为17.5 μm×8.7 μm，基部细胞弯曲状。该病原菌接种苹果4 d后，出现褐色腐烂，8 d后出现淡粉色霉层及分生孢子。分离获得的菌株Tr-1685鉴定为粉红聚端孢菌，与实时荧光PCR结果一致。

关键词：粉红聚端孢菌（Trichothecium roseum）； 入境旅客； 苹果； 鉴定； 实时荧光定量PCR检测方法

中图分类号：S41-32；S436.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）02-0067-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.017

Abstract： The real-time PCR method of Trichothecium roseum was developed for the first time， and the method of T. roseum appeared high amplification efficiency and good specificity. Sensitivity of the method reached to 0.1 pg mycelium DNA amount. The isolate Tr-1685 similar to T. roseum which was obtained from imported apple carried by airport incoming passenger had been detected and identified using real-time PCR along with morphology obersevation and pathogenicity test. The real-time PCR result of the isolate Tr-1685 showed positive. The isolate bacterial strain grew fast on PDA media. The colony was flat and irregular in appearance，covered by light pink mould which produced lots of conidia. Conidiophores of the isolate were erect and different in length，which bore conidia at the tip. Conidia of the isolate was 17.5 μm×8.7 μm on average，which was smooth and clavate. Each conidium was two celled with curved basal cell. The isolate caused brown rot on apple 4 d after inoculation. Pinkish mould and conidia appeared 8 d after inoculation. The isolate Tr-1685 was identified as T. roseum，consistent with the result of the real-time PCR.

Key words： Trichothecium roseum； incoming passengers； apple； identification； real-time PCR

粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）在分类上属于子囊菌亚门、肉座菌目（Hypocreales）。该病菌的同物异名包括Trichothecium roseum、Hyphelia rosea、Puccinia rosea、Cephalothecium roseum和Dactylium roseum[1]。该菌在全世界多国广泛分布，可以在不同的环境中生长，从落叶到水果上均可以发生，引起粉红色腐烂症状，给农业造成经济影响。同时，粉红聚端孢菌可以产生多种次级代谢产物，包括真菌毒素，比如粉红霉素B（Roseotoxins）和单端孢霉烯族毒素（Trichothecenes），可以侵染并毁坏多种水果，并会对人类健康带来重要影响[2]。该病原菌在苹果、葡萄、番茄、西瓜和桃上都有危害的报道[2-7]。引起的病害曾在中国苹果园引起巨大损失。该病菌既能在果园中引起危害，又能为害储藏期果实，并可在果实中潜伏侵染，随病果远距离传播。

最近，徐州观音国际机场口岸从入境旅客携带的苹果中截获一批病果，对病果进行分离培养，发现为疑似单端孢属病原菌。继续对该病原菌进行形态学观察，首次建立了T. roseum实时荧光PCR分子检测方法，并根据柯赫氏法则（Kochs postulates）进行了致病性测定，对该批病苹果携带的病菌进行了检测和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 病原菌分离材料为徐州观音国际机场入境旅客携带物中截获的可疑苹果病果，将疑似粉红聚端孢菌的菌株编号为Tr-1685。致病性测定接种材料为健康苹果。endprint

1.1.2 参试菌株 选择从苹果上分离到的不同地理来源的粉红聚端孢菌12份菌株，以及其他经常在苹果上发生的、不同已知地理来源的35种重要苹果病原菌（表1）进行实时荧光定量PCR分子检测。

1.1.3 主要试剂 HR qPCR Master Mix购自上海辉睿生物科技有限公司；EASY Dilution购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 实时荧光定量PCR分子检测方法的建立

1.2.1 TaqMan引物与探针的设计与合成 通过GenBank网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载所有粉红聚端孢菌ITS基因序列，根据该物种ITS基因的保守序列区域及其中一个粉红聚端孢菌菌株（登录号：EU552162.1），设计如下一对寡核苷酸引物和TaqMan探针，并对设计的引物和探针在GenBank网站上进行同源性分析。TR-ITS-FP：5′-GACCACACGAACCCTGTTTAA-3′（194-214）；TR-ITS-RP：5′-ATTTCGCTGCGTTCTTCATC-3′（298-317）；TR-ITS-P：5′FAM-TGAGCGAGCCGAAAGGCAACAAA-BHQ1 3′（232-254）。其预期的扩增产物大小为124 bp。引物与探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.2.2 DNA提取 直接采用经典的CTAB法大量提取病菌基因组DNA，测定DNA浓度及纯度，-20 ℃保存备用。对已经培养好的其他参试菌株少量提取菌丝DNA，可以采用Tooley等[8]的碱裂解法快速提取。取少量菌丝块放入2 mL的离心管中，加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直径3 mm的钢珠，在球磨仪（Retsch MM400德国）上以30次/s的频率振荡5 min。12 000 r/min离心10 min，取上清液以100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）稀释10倍。DNA提取后直接进行实时荧光PCR检测。

1.2.3 实时荧光定量PCR反应体系及反应条件 20 μL实时荧光定量PCR反应体系中含以下组分：HR qPCR Master Mix（2×）10 μL、上游引物TR-ITS-FP（10 μmol/L）及下游引物TR-ITS-RP各0.8 μL，TaqMan探针TR-ITS-P（10 μmol/L） 0.2 μL，DNA模板（1～10 ng）1 μL，补ddH2O至20 μL。

实时荧光定量PCR反应条件：50 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环。实时荧光定量PCR反应在ABI PRISM 7500 FAST实时荧光PCR仪上进行，扩增反应无需设置ROX校正。

1.2.4 实时荧光定量PCR特异性试验 选择从苹果上分离到的不同地理来源的粉红聚端孢菌12份菌株及疑似菌株Tr-1685，以及其他经常在苹果上发生的、不同地理来源的35种重要苹果病原菌进行实时荧光定量PCR特异性验证。

1.2.5 实时荧光定量PCR灵敏度试验 选取粉红聚端孢菌标准菌株ATCC？誖13412TM，采用经典的CTAB法提取菌丝体总DNA，并在超微量分光光度计（OneDrop OD-2000+）测定DNA浓度及纯度。对提取的DNA定量为1 μg/μL，采用EASY Dilution对DNA溶液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度逐级稀释，各取1 μL进行实时荧光定量PCR灵敏度试验。此时20 μL PCR反应液中的DNA添加量分别相当于100、10、1 ng和100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 pg的菌丝体DNA量。阴性对照为ddH2O。1.3 病原菌的组织分离与培养

先用75%乙醇对果实进行表面消毒，待乙醇挥发后，从病健交界处切取或用镊子撕取边长约为5 mm的样品，放在马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，25 ℃黑暗条件下培养。观察病菌菌落的生长情况，将长出的菌落及时置于新的PDA平板上进行纯化。

1.4 病原菌形态学观察与生物学测定

對纯化的疑似菌株继续在25 ℃黑暗条件下培养，对菌落的形态、颜色、生长速度、产孢量、分生孢子梗和分生孢子等形态特征进行观察和生物学性状测定。培养3 d后开始测量菌落直径。在显微镜（ZEISS Imager M1）下观察并拍摄分生孢子形态，测量其大小，根据病菌的形态特征进行鉴定。

1.5 病原菌PCR扩增及序列分析

采用真菌通用引物ITS4/ITS5（ITS4：5′-TCCTCC

GCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGTAAAAGT

CGTAACAAGG-3′）对菌株Tr-1685基因组DNA进行PCR扩增。反应体系为：10×Buffer 5 μL（含Mg2+）、dNTP 1.0 μL（10 mmol/L）、引物各2.0 μL（10 μmol/L）、rTaq 0.4 μL（5 U/μL）模板DNA 2 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环的扩增；72 ℃延伸7 min后，保存于4 ℃。将PCR产物送往南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序，并进行序列分析。

1.6 致病性测定

采用菌丝块接种法。用4 mm孔径的打孔器在菌株Tr-1685的菌落边缘打孔取样，作为接种菌丝块。选用新鲜健康的苹果果实，先用75%乙醇对要接种的果实表面进行消毒，再用相同的打孔器在接种部位打孔，切取少量果肉留下果皮，将菌丝块接入果肉孔中后，盖上果皮。将接种的苹果放入无菌塑料袋中，25 ℃黑暗条件下保湿培养。同时设置无菌水接种作为对照。观察记录发病情况，并对果实的发病部位重新进行病原菌的分离培养，与接种菌株Tr-1685比较形态特征。endprint

2 结果与分析

2.1 实时荧光定量PCR检测方法的建立

2.1.1 实时荧光PCR特异性试验结果 实时荧光定量PCR扩增的结果表明，11份不同地理来源的粉红聚端孢菌均具有良好的扩增曲线，标准菌株ATCC13412TM Ct为17.36，其他参试菌株序号2～11的Ct分別为17.36、18.34、17.00、17.45、11.36、10.40、17.25、19.71、24.50、14.24和10.39（图1），疑似菌株Tr-1685 Ct为12.10，均为阳性扩增；而其他经常在苹果上发生的、不同地理来源的35种重要苹果病原菌和阴性对照均无扩增曲线，Ct>35。表明所设计的引物、探针，实时荧光定量PCR反应体系和反应条件均能满足粉红聚端孢菌的实时荧光定量PCR的特异性检测需要。

2.1.2 实时荧光定量PCR灵敏度试验结果 实时荧光定量PCR灵敏度试验的结果表明，粉红聚端孢菌菌丝体DNA量从1 μg到0.1 pg范围内，可以得到较好的实时荧光定量检测结果（Ct<35）（图2），Ct从小到大依次为13.19、16.18、19.60、23.27、26.50、29.99、32.75和34.49，表明所建立的实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达0.1 pg。

根据图2制作出的粉红聚端孢菌实时荧光定量PCR的标准曲线见图3（R2=0.995）。

2.2 病菌生物学特性及形态特征

2.2.1 菌落特征 取病果病健交界处果皮进行组织分离，对疑似菌落Tr-1685粉红聚端孢菌进行纯化，取直径4 mm菌丝块在PDA上25 ℃黑暗条件下培养，菌落生长速度较快，10 d后菌落布满直径9 cm培养皿。菌落特征表现为平展、呈颗粒状和粉状。菌落边缘的颜色刚开始为白色，之后变为淡淡的粉红色，至桃红色。菌落边缘生长不规则，产孢量丰富，菌落表面形成粉红色的分生孢子堆，粉红色霉层呈不规则轮纹形（图4）。

2.2.2 病菌无性阶段形态特征 经显微镜观察，疑似菌株Tr-1685菌丝无色，有分枝。分生孢子梗直立，长短不一，在测量的30根分生孢子梗中，最短的为84.5 μm，最长为188.5 μm，单生或簇生，可在顶端产生单生的或成簇的分生孢子。这些分生孢子梗早期与营养生长的菌丝难以区分，直至产生无性孢子。分生孢子从分生孢子梗顶端上不同方向上逐一脱落。成熟的分生孢子平均大小为17.5 μm×8.7 μm，光滑，棍棒状（图5）。分生孢子双细胞，顶部细胞比弯曲的基部细胞稍大。分生孢子堆呈淡粉红色，而在显微镜下为半透明状。在培养基或寄主表面大量生长时表现为饱满的粉红色。

2.3 ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS4/ITS5对菌株Tr-1685基因组DNA进行PCR扩增后，双向测序及拼接，并在GenBank上进行Blast比对。结果表明，菌株Tr-1685的核苷酸序列与粉红聚端孢菌菌株（基因登录号EU552162和JQ434579）的同源性最高，达到100%。

2.4 致病性测定

采用菌丝块对新鲜健康的苹果果实进行接种，经保湿培养，苹果果实3～4 d在接种部位出现褐色病斑，病斑扩展较慢，8 d时在接种部位表面及周围出现大量粉红色霉层（图6A），其上产生淡粉色分生孢子。剖开发病的病果，可见果肉部分出现褐色病斑，向果核方向扩展（图6B）。对照无上述症状出现，亦无粉红色霉层产生。从接种发病的苹果果实上可重新分离到性状相同的菌株。致病性测定结果表明，该菌株可以侵染苹果果实。

3 小结与讨论

通过对苹果病果上分离到的菌株Tr-1685进行实时荧光定量PCR分子检测和致病性测定及形态学观察，确定从徐州观音国际机场入境旅客携带的苹果中分离的病原菌Tr-1685为粉红聚端孢菌。

单端孢属（Trichothecium）于1809年首次报道[2]，目前包含73个记录种，缺乏有性阶段[2]。该属的主要成员包括T. polybrochum、T. cystosporium、T. pravicovi和T. roseum[2]。粉红聚端孢菌的分生孢子梗和分生孢子在形态上与其他3个主要种有所差异[2]，因此，近年来对该属的鉴定重点集中在对这些形态特征的研究上。另外，在分子检测方面，目前还是采用常规PCR检测方法，针对真菌基因组ITS区域和β-tubulin（TUB）基因5′端进行PCR扩增[7]，然后对PCR产物进行测序，再进行序列分析和系统进化聚类分析，最终确定其种类。

本研究首次建立了粉红聚端孢菌实时荧光定量PCR分子检测方法。在对引物和探针设计时，对设计的探针TR-ITS-P在GeneBank网站上进行序列比对，要求与所有粉红聚端孢菌不同地理的菌株同源性达到100%；并且尽量增大种间差异，如单端孢属的3个主要成员T. polybrochum、T. cystosporium、T. pravicovi与TR-ITS-P序列的同源性在80%以下，保证设计的引物和探针具有很好的特异性。同时，在建立实时荧光定量PCR反应体系过程中，不断优化反应体系，降低探针终浓度，调整引物和探针浓度最佳比例；摸索反应条件，提高退火温度从56 ℃到60 ℃。在进行特异性验证时，尽量多选取不同地理来源的粉红聚端孢菌阳性菌株和其他不同地理来源的重要苹果病原菌35种进行测试。结果表明，所建立粉红聚端孢菌实时荧光定量PCR分子检测方法具有准确、快速、灵敏度高、特异性好、稳定性高等特点，适合对该病原菌开展快速鉴定，尤其是早期诊断。

粉红聚端孢菌全世界发现大约有220种不同的植物寄主，在很多水果和蔬菜上引起红腐症状[3]。该病害早期会出现白色粉状霉层，最后发展为粉红色。虽然有报道该病菌通常是次要致病菌[2]，具有一定的腐生性，但是越来越多的证据表明，该病菌具有较强的致病性。在中国该病菌可引起苹果心腐病，造成严重的经济损失[4]；在韩国，该病菌可以引起葡萄发病，菌丝布满果实表面，严重降低葡萄的品质[5]；在韩国和巴基斯坦，有报道该病菌可以侵染番茄[6，7]；在日本、美国、南美洲、印度和英国有报道该病菌可以侵染厚皮甜瓜和西瓜，引起红腐病[3]；在香蕉和桃上也有发生危害的报道[3]。endprint

研究表明粉红聚端孢菌产生的次级代谢产物粉红霉素B[9]，可以穿透苹果果皮，形成病斑。同时，该病菌会产生较高水平的真菌毒素，如T-2毒素是单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种[4]，由于其致癌性，具有神经毒性和免疫毒性，对食用感染该病苹果的人群會造成潜在的威胁。同时，该病菌引起葡萄病害，其产生的单端孢菌素（Trichothecin）和玫瑰菌素（Rosenonolactone）还会出现在葡萄酒中[10]，造成潜在的健康风险。

粉红聚端孢菌既能在果园和蔬菜基地引起危害，又能为害储藏期的水果和蔬菜，并可在果实中潜伏侵染，随病果远距离传播。加强对水果和蔬菜上粉红聚端孢菌的检测和检疫，重视该病菌的发生、传播和防治，对保障中国水果安全生产和人类健康都具有重要意义。

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