制备型色谱柱对黑豆皮花青素分离纯度的影响

李 媛，谢岩黎

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

制备型色谱柱对黑豆皮花青素分离纯度的影响

李 媛，谢岩黎*

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

以黑豆皮为原料，采用超声波辅助法提取3种黑豆皮花青素，利用高效液相色谱法对其进行定性定量分析，然后用两种不同型号的制备型色谱柱分离纯化含量最高的黑豆皮花青素，并鉴定其纯度。结果表明：3种黑豆皮花青素中的主要成分是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G），其中东北黑豆皮花青素中C3G含量最高，为959.7 mg/100 g，其次是山西黑豆皮花青素。用两种色谱柱纯化东北黑豆皮花青素制备C3G，色谱柱1 C18（77 mm×450 mm，10～100滋m）分离的C3G纯度为77.2%，色谱柱2 C18（19 mm×150 mm，5.0滋m）分离的C3G纯度为97.0%，色谱柱2分离的C3G可以代替标品，适合实验室小量制备并做后续性质的研究。

黑豆皮花青素；纯化；制备型色谱柱

0 引言

花青素作为抗氧化、抗癌、预防心血管疾病、有益于细胞信号传导和基因表达的一类活性物质[1]，从发现、研究到现在，其提取与纯化技术已经相当成熟。花青素的提取技术有溶剂提取法、超声波辅助法、超临界流体萃取法、微生物发酵提取法、超高压辅助提取、微波辅助提取等[2]，每种方法都有各自的优缺点，现在较常用的是两种或多种技术协同萃取技术，特点是提取率高、花费时间短、提取物结构比较稳定。

由于提取物中含有杂质，杂质会干扰研究目标物质的特性，所以很有必要对提取物进行纯化，除去杂质。纯化花青素的方法[2]有柱层析、高效液相色谱法、固相萃取法、高速逆流色谱法等。柱层析成本低，但效率低，耗费时间长。高效液相色谱法和固相萃取法操作简单，不污染环境，是近年来广泛使用的、有效的提纯方法。对于花青素的定性定量分析[3-4]，常用的是紫外分光光度法、高效液相色谱法、液质联用、核磁共振等方法。在前人研究的基础上，本文直接采用提取率高的超声波辅助-溶剂法[5-6]提取黑豆皮花青素，使用制备型液相色谱仪纯化花青素提取物；利用Waters高效液相色谱仪对纯化前后的花青素进行定性定量分析及纯度鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东北黑豆产自黑龙江省双鸭山市；山西黑豆和安徽黑豆购自盛禾农超市；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）：纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司。

乙腈（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；实验所用的盐酸、冰乙酸和95%乙醇等化学试剂：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；AB-8型大孔吸附树脂：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1600PC紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；Waters 2695-2998高效液相色谱仪：美国Waters公司；制备型液相色谱仪：GLPIDC18柱（77 mm×450 mm，10～100 滋m）：北京创新通恒科技有限公司；Prep 150制备液相色谱仪：C18柱（19 mm×150 mm，5.0 滋m）：美国 Waters公司。

1.3 超声波辅助法提取黑豆皮花青素

黑豆原粒低温烘干，人工去皮，使用超微粉碎机将黑豆皮粉碎成末，过40目筛。称取10份3 g的黑豆皮粉末，以1∶25的料液比加入相对应体积的60%乙醇溶液（pH 2.0），在50℃条件下超声30 min，收集上清液，重复3次，至浸提液接近于无色即可，收集上清液，置于旋转蒸发仪上，在37℃条件下真空浓缩除去乙醇，得到粗提液，以3 500 r/min高速离心15 min后密封避光保存。

1.4 紫外-可见光分光光度法确定黑豆皮花青素的特征吸收峰

用紫外分光光度计对提取的黑豆皮花青素及标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）进行波长为200～800 nm的扫描。

1.5 高效液相色谱法测定黑豆皮花青素的含量

用10%盐酸水溶液把5.0 mg C3G溶解并定容至25 mL容量瓶，即为200 μg/mL标品储备液，然后用 10%盐酸水溶液分别稀释成 10、25、50、100、200 μg/mL C3G标准溶液。溶液过0.22 μm滤膜，进样，以标准液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

通过查阅文献[7-8]，加上前期摸索，确定色谱条件。 色谱柱： C18柱（250 mm×4.6 mm,5.0 μm）；流动相A：5%乙酸水溶液；流动相B：100%乙腈；流速：0.8 mL/min；进样量：20.0 μL；柱温：30 ℃；检测波长：520 nm；进入液相之前，提取液要先过0.22 μm 滤膜。洗脱程序如下：0 min，6%B；4 min，14%B；7 min，20%B；12 min，22%B；14 min，27%B；17 min，35%B；20 min，25%B；22～25 min，6%B。

1.6 树脂纯化黑豆皮花青素

将一定量预处理过的AB-8大孔树脂缓慢装柱，填充均匀后，把适量的花青素粗提液装入AB-8柱中，待树脂吸附饱和，再用75%乙醇水溶液进行解吸，收集洗脱液。再将洗脱液置于37℃旋转蒸发仪上真空浓缩，除去溶剂后即可。

1.7 制备型液相色谱仪纯化黑豆皮花青素

采用两种不同的色谱柱来纯化[9-10]提取的黑豆皮花青素。

（1）GLP-ID C18柱。纯化条件：流动相 A为10%乙腈，流动相B为90%的0.2%醋酸，等度洗脱；流速为 80 mL/min，柱温为室温，紫外检测器检测波长为 520 nm，进样量为 40 mL。制备液相纯化后的花青素溶液经旋转蒸发仪除去溶剂，然后用冷冻干燥机干燥成粉末，储存于-20℃备用。

（2）C18柱。纯化条件：流动相A为5%乙酸水溶液；流动相B为100%乙腈；流速为10 mL/min；进样量为1 mL；柱温为室温；检测波长为520 nm。洗脱程序是在分析液相的基础上改进得到，具体洗脱程序为：0 min，6%B；4 min，14%B；7 min，20%B；8.45～12 min，20.6%B；14～17 min，6%B。

1.8 数据处理

使用Excel和Originpro 8.5.1软件对实验数据进行统计及处理。

2 结果与讨论

2.1 黑豆皮花青素最大紫外可见波长的确定

利用紫外分光光度计扫描花青素在200～800 nm范围内的紫外可见图谱，是为了确定花青素的紫外可见最大吸收波长，进而确定测定液相的扫描波长。根据文献 [11]，花青素的特征吸收峰在500～600 nm范围内，图1是标品C3G、东北黑豆花青素水溶液和东北黑豆花青素乙醇溶液的紫外可见吸收曲线，其中花青素的最大可见吸收波长分别为520 nm、515 nm和530 nm，说明花青素紫外可见特征吸收峰与所用溶剂有关。此外，在文献中查到，一些研究者[12]实验时直接借鉴前人的测定波长；韩国黑豆皮花青素[13]的液相图谱测定采用甲醇和水作为流动相，检测波长为530 nm；美国黑豆皮花青素[14]的液相鉴定使用乙腈和水作为流动相，检测波长为520 nm，这与本实验液相所用的流动相是一致的，结合紫外扫描的标品C3G的最大吸收波长，确定液相的扫描波长为520 nm。

2.2 高效液相色谱法鉴定黑豆皮花青素组分

由于食品中主要有6种花青素苷元，而自然界中矢车菊色素最为丰富，结合阅读文献的相关报道，选取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为标品，测定3种黑豆样品中花青素的含量。由图2可知，标品C3G的色谱峰保留时间为6.792 min，东北黑豆皮花青素提取物和山西黑豆皮花青素提取物的主峰的色谱峰保留时间分别为6.840 min和6.895 min，而安徽黑豆皮花青素提取物在6.8 min左右也出现一个液相色谱峰，说明3种黑豆皮花青素中主要成分均为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。同时，安徽黑豆皮花青素提取物在5.940 min出现一个色谱峰，参考之前的研究成果[13]，推测极有可能是飞燕草素-3-O-葡萄糖苷。实验利用外标法建立标准曲线，发现在10～200 mg/L内标准液的质量浓度与峰面积呈线性关系，线性方程为Y=45.455 04X+45.842 49，R2=0.999 82，利用峰面积法算得东北、山西和安徽3种黑豆皮花青素中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量分别为959.7、572.2、165.0 mg/100 g，其中东北黑豆皮花青素中C3G含量最高，所以，接下来的实验样品均采用东北黑豆皮花青素。

图2 标品C3G和3种黑豆皮花青素的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of cyanidin-3-O-glucoside standard and anthocyanins extracts of three kinds of black bean coats

2.3 两种色谱柱分离C3G的结果及纯度分析

由于标品C3G的价格昂贵，所以后续实验所用到的C3G需要自己制备。实验开始使用AB-8大孔树脂纯化黑豆皮花青素提取物，经液相色谱仪测定发现纯度提高不超过10%，而且耗费时间长。为了使C3G的纯度达到95%以上，同时能够节约时间，选择采用制备型液相色谱仪方法纯化东北黑豆皮花青素，选用色谱柱1 C18和色谱柱2 C18两种柱子进行分离。色谱柱1的进样量大，进样量为10～300 mL，分离效率高，所用时间短，适合大批量生产。图3为色谱柱1 GLP－ID C18分离C3G的液相色谱图，图3中组分Ⅰ经液相鉴定主要是杂质，组分Ⅱ经过鉴定其主要成分是C3G，最后把达到目标纯度的所用样品混合进行除溶剂及冷冻干燥。

图3 色谱柱1 C18（77 mm×450 mm，10～100 μm）分离C3G的液相色谱图谱Fig.3 The liquid chromatogram of C3G separated by chromatogram column 1 C18（77 mm×450 mm，10～100 μm）

色谱柱2的特点是进样量小，每次最多进样1 mL，分离精确度高，自动收集，操作简单方便。但是制备较大的样品量，所需时间长。色谱柱2分离C3G的液相色谱图见图4，图4中标注的3个液相色谱峰的保留时间分别为 3.25、6.44、7.30 min，其中7.30 min处的液相色谱峰为目标峰，根据几次试样运行的结果，实验只收集保留时间为6.8～8 min、峰值大于100 mAu的液体，以减少杂质的含量，保证C3G的纯度。

图4 色谱柱2 C18（19 mm×150 mm，5.0 μm）分离C3G的液相色谱图谱Fig.4 The liquid chromatogram of C3G separated by chromatogram column 2 C18（19 mm×150 mm，5.0 μm）

为了鉴定两种色谱柱制备的C3G的纯度，使用Waters高效液相色谱法扫描标品和2种纯化样品的光谱，结果发现检测波长为520 nm和280 nm时，3种样品均在6.80 min附近出现一个液相色谱峰，此外，色谱柱1 C18在4.27 min有一个非常明显的液相色谱峰，说明有杂质存在。利用高效液相色谱标准曲线法，计算两种色谱柱制备的C3G纯度，发现色谱柱1 C18制备的C3G纯度为77.2%，色谱柱2 C18分离制备的C3G纯度为97.0%，与标品非常接近，因此后续实验用到的C3G样品可以由液相色谱柱2分离得到。

3 结论

本文主要研究超声波辅助法提取黑豆皮花青素与制备液相色谱仪纯化黑豆皮花青素，并对提取物与纯化物分别进行鉴定及分析。得到以下结论：（1）通过利用高效液相色谱法测定3种黑豆皮花青素中C3G的含量，发现东北黑豆皮花青素中C3G含量最高，为959.7 mg/100 g，其次是山西黑豆皮花青素，安徽黑豆皮花青素中C3G含量最少。（2）采用两种色谱柱纯化东北黑豆皮花青素而制备C3G，经过纯度分析表明，色谱柱2 C18分离的C3G的纯度比色谱1 C18高，纯度为97.0%，因而可以代替标品做实验室研究。

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PURIFICATION OF ANTHOCYANINS FROM BLACK BEAN COATS BY PREPARATIVE CHROMATOGRAPHIC COLUMNS

LI Yuan，XIE Yanli
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

Anthocyanins are a class of active substances which have the ability of antioxidant，anti-cancer，preventing cardiovascular，and benefits for cellular signaling and gene expression. Anthocyanins from three kinds of black bean coats were extracted by ultrasonic assisted method and then qualified and quantified by high performance liquid chromatography（HPLC） in the present study. The anthocyanins which had the highest content in the three kinds of black bean coats were separated and purified by two different types of preparative columns and their purities were identified，respectively. The results showed that the main component of anthocyanins in the three kinds of black bean coats was cyanidin-3-O-glucoside （C3G），while the Northeastern black bean coats had the highest content of C3G （959.7 mg/100g），followed by Shanxi cultivar. Two kinds of preparative columns were used to purify C3G from the Northeastern black bean coats anthocyanins. The purities of C3G isolated by column 1 C18（77 mm x 450 mm，10～100 μm） and column 2 C18（19 mm×150 mm，5.0 μm）were 77.2% and 97.0%，respectively. The C3G isolated from the column 2 could be used instead of the standard product and this method was suitable for the small amount laboratory preparation of C3G.

anthocyanins of black bean coats；purify；preparative chromatography column

TS201.2

B

1673-2383(2017)06-0021-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171226.1723.008.html

网络出版时间：2017-12-26 17:24:10

2017-03-09

国家“十三五”重点研发计划专项课题（2016YFD0400203）；河南工业大学“省属高校基本科研业务费专项资金”项目（2014YWJC06）；河南省谷物资源转化与利用重点实验室开放课题（PL2017009）

李媛（1990—），女，河南新密人，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。

*通信作者