曲匹地尔与阿司匹林对糖尿病小鼠血小板活性影响的比较

付德池，杨朝令，汪宏良，李仲娟

(1大冶市第四人民医院，湖北黄石435115；2湖北理工学院医学院)

曲匹地尔与阿司匹林对糖尿病小鼠血小板活性影响的比较

付德池1，杨朝令2，汪宏良2，李仲娟2

(1大冶市第四人民医院，湖北黄石435115；2湖北理工学院医学院)

目的探讨曲匹地尔对糖尿病小鼠血液中血小板活性的影响及其与阿司匹林相比的效果。方法选择100只健康小鼠，10只为非模型对照组，90只通过腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型。取造模成功的60只小鼠，随机分为生理盐水组、阿司匹林组和曲匹地尔组各20只，分别给予生理盐水10 mL、曲匹地尔和阿司匹林25 mg/kg 10 mL灌胃，1次/d，连续3 d。3 d后，生理盐水组、阿司匹林组和曲匹地尔组于灌胃后90、120和150 min时尾静脉血取血，同法取非模型对照组尾静脉血。制备富血小板血浆(PRP)及乏血小板血浆(PPP)，用比浊法进行血小板聚集性测定，记录血小板聚集率，计算血小板抑制率。结果生理盐水组血小板聚集率高于非模型对照组，曲匹地尔组、阿司匹林组血小板聚集率均低于生理盐水组(P均<0.01)。曲匹地尔组、阿司匹林组血小板抑制率均高于生理盐水组，曲匹地尔组血小板抑制率高于阿司匹林组(P均<0.01)。90、120、150 min时曲匹地尔组血小板抑制率均高于阿司匹林组(P均<0.01)。结论曲匹地尔与阿司匹林均能抑制糖尿病小鼠的血小板聚集，曲匹地尔抗血小板聚集效果强于阿司匹林，对血小板活化抑制时间更持久。

曲匹地尔；阿司匹林；血小板聚集；血小板抑制率；糖尿病；心血管疾病

我国糖尿病患者数量居于全球首位，20岁以上的人群糖尿病患病率为9.7%[1]。随着病情的进展，血栓和心脑血管并发症成为影响糖尿病患者生活质量和威胁生命的主要原因。因此，抗血小板治疗成为预防糖尿病患者心脑血管并发症和缺血性事件发生的重要策略[2]。在常用抗血小板聚集药物中，阿司匹林是这类疾病的一级预防药物，但对于糖尿病、动脉硬化、冠心病和脑梗死等高危患者而言，由于其存在较高的血小板聚集率，阿司匹林的应用效果并不理想[3,4]。阿司匹林的抗血小板聚集原理为不可逆地灭活乙酰化环氧化酶-1(COX-1)中529位丝氨酸的羟基酶活性，从而阻止血栓素A2(TXA2)的形成[5,6]。而三嘧啶衍生物的曲匹地尔则具有不同的抗血小板原理，其是通过抗血小板衍生生长因子受体而发挥作用[7]。近年研究也表明，曲匹地尔可显著改善糖尿病患者的视网膜病变，并能促进血管内皮细胞的增生[8,9]。2016年3～10月，我们以阿司匹林作为对照，观察曲匹地尔对糖尿病模型小鼠血小板活性的影响，为糖尿病患者并发心血管疾病的药物选择提供依据。

1 试药与仪器

1.1 动物、试剂及仪器 选择健康昆种小鼠100只，体质量25～35 g，饲养于通风良好，温度在18～22 ℃环境。曲匹地尔由迪奥药业提供。四氧嘧啶和二磷酸腺苷和二磷酸腺苷购自美国Sigma公司；阿司匹林购自武汉宏信康精细化工有限公司。PACKS-4的多通道血小板凝集度仪购自美国海伦娜公司。

1.2 模型构建、动物分组与干预方法 适应性饲养小鼠1周后，取90只腹腔注射四氧嘧啶注射液70 mg/kg进行糖尿病建模[10]，48 h后取尾静脉血检测血糖，以>8 mmol/L为造模成功。剩余的10只大鼠腹腔注射等量生理盐水作为非模型对照组。将造模成功小鼠随机分为生理盐水组、阿司匹林组和曲匹地尔组各20只，曲匹地尔组及阿司匹林组均按25 mg/kg曲匹地尔或阿司匹林灌胃，1次/d，连续3 d，生理盐水组仅使用生理盐水10 mL同法进行灌胃。第3天灌胃后分别取不同时间点血液备用。

1.3 取材方法 生理盐水组、阿司匹林组和曲匹地尔组干预90、120和150 min时，分别于尾部取血1.5 mL，并取非模型对照组尾静脉血，加入3.8%枸橼酸钠抗凝，收集于洁净的塑料离心管保存。

1.4 血小板血浆的制备

1.4.1 富血小板血浆(PRP)制备方法 取各组不同时间点血液，100 r/min离心15 min。使用移液枪吸取离心后血液样本上层的PRP放于一次性塑料试管内，标记为PRP。加盖并在室温下保存，稳定30 min后待测。

1.4.2 乏血小板血浆(PPP)制备方法 取各组不同时间点血液，1 600～2 000 r/min离心15 min，使用移液枪吸取离心后血液样本上层血浆并标记为PPP，用PPP稀释PRP使血小板密度为1×1011/L。在25 ℃下保存，所有检测标本在采集后3 h内完成。

1.5 血小板凝聚率及抑制率测定 取各组各时间点PPP及PRP，按照PACKS-4多通道血小板凝集度仪说明书操作。准备PPP和PRP及诱导剂，吸取微量或标准量PPP到检测杯里，加入微量或标准量PRP样本。37 ℃孵育PRP 3 min，用PPP空白设置100%聚集。将已预温好的PRP检测杯插入与PPP对应的通道，用加样器将试剂加入检测杯，按下通道键用PRP设置聚集水平为0。将装有250 μL乏血小板血清的石英杯放入通道检测，取装有225 μL富血小板血清石英杯，将磁珠横向放入石英杯中。将石英杯放入检测通道中，抽取25 μL二磷酸腺苷(ADP)，将试剂垂直打入石英杯检测。根据仪器打印出的聚集曲线及最大聚集率，分析药物对ADP诱导1 min后血小板聚集的影响。用比浊法进行血小板聚集性测定，记录血小板聚集率。以[(对照管聚集率-样品管聚集率) / 对照管聚集率]计算血小板抑制率[11]。由于90 min时间点是诱导剂ADP作用后的峰值点，比较该时点各组的血小板聚集率及血小板抑制率。

2 结果

2.1 各组干预90 min时血小板聚集率比较 非模型对照组及模型小鼠生理盐水组、曲匹地尔组、阿司匹林组90 min时血小板聚集率分别为15%±0.36%、55%±0.22%、18%±0.48%、40%±0.56%，模型小鼠生理盐水组、曲匹地尔组、阿司匹林组血小板聚集率均高于非模型对照组(P均<0.01)。模型小鼠曲匹地尔组、阿司匹林组血小板聚集率均低于生理盐水组(P均<0.01)。曲匹地尔组血小板抑制率低于阿司匹林组(P<0.01)。

2.2 各组干预90 min时血小板抑制率比较 生理盐水组、曲匹地尔组、阿司匹林组血小板抑制率分别为0、67.2%±0.36%、27%±1.32%，曲匹地尔组、阿司匹林组血小板抑制率均高于生理盐水组，曲匹地尔组血小板抑制率高于阿司匹林组(P均<0.01)。

2.3 曲匹地尔组和阿司匹林组不同时间点血小板抑制率比较 曲匹地尔组和阿司匹林组干预90 min时血小板抑制率均高于其他两时间点(P均<0.01)。各时间点曲匹地尔组血小板抑制率均高于阿司匹林组(P均<0.01)。

表1 各组不同时间点血小板抑制率比较

注：与阿司匹林组比较，*P<0.05；与同组90 min时比较，﹟P<0.01。

3 讨论

糖尿病不仅促进动脉硬化，同时也增加了心血管疾病的发病概率[12]。糖尿病患者并发血栓和心脑血管症时，由于患者血小板膜流动性下降，Ca2+、Mg2+代谢发生变化，花生四烯酸和TXA2增加，前列环素和抗氧化物质减少，导致血小板聚集异常及血液流变学改变[13],血栓形成的风险变大。同时，TXA2的升高，还会引起冠状动脉痉挛，使心肌微循环发生障碍。诱发更为严重的血管事件。阿司匹林可有效预防糖尿病患者的心脑血管事件，但一级预防研究 (PPP)显示，阿司匹林并不能减少心血管病因死亡、心肌梗死和脑卒中等严重的血管事件的发生率，可能与糖尿病患者体内存在阿司匹林抵抗相关[14]。曲匹地尔学名为7-二乙基-5-甲基s-三氮唑(1,5-a)嘧啶，早期用于抗心绞痛，上世纪九十年代被日本药典(12版)收载，并用于糖尿病并发血栓和心脑血管症时的临床治疗。曲匹地尔具有扩张冠状动脉、改善糖尿病脂质代谢和降低血小板聚集等作用[15]。其抗血小板聚集通过抑制血栓素合成，促进前列环素生成、激活腺苷酸环化酶，促进环磷酸腺苷(cAMP)生成增多，抑制磷酸二酯酶活性，减少cAMP水解。血小板内cAMP 增多能激活细胞膜的转运而稳定钙的贮藏池，使细胞质内游离Ca2+含量降低，从而阻断血小板的激活。虽然曲匹地尔与阿司匹林在体内抗血小板活化机理部分存在相同[16]，但曲匹地尔对体内存在阿司匹林抵抗的糖尿病患者有着不可替代的优势。曲匹地尔与阿司匹林对糖尿病患者的抗血小板活化作用差异尚不明确。

血小板功能异常及血液流变学的改变在患者血栓形成过程中具有重要作用。血小板聚集率和血小板的抑制率都是血小板活化的一个体外评价指标。血小板在二磷酸腺苷的诱导下出现活化，比浊法测定血小板聚集率，通过仪器设定空白对照可以计算出血小板的抑制率。药物干预后血小板聚集率的改变，是药物对血小板活化能力的体现。血小板聚集率升高时，血小板黏附和聚集能力增加，释放反应及促凝活性增强，导致血液流变学改变[17]，增加糖尿病患者发生严重的血管事件。在糖尿病模型小鼠中，90 min时间点是诱导剂ADP作用后的峰值点，也是考察药物干预效果的最佳点。本研究结果显示，生理盐水组血小板聚集率高于非模型对照组，提示模型小鼠体内血小板活性高于非模型对照组血小板活性;曲匹地尔组、阿司匹林组血小板聚集率均低于生理盐水组，提示药物干预后，血小板活性受到抑制。

血小板的抑制率是抗凝药物效果的直接评价。本研究发现，曲匹地尔组、阿司匹林组血小板抑制率均高于生理盐水组，提示抗凝药物可阻断血小板的激活；曲匹地尔组血小板抑制率高于阿司匹林组，提示曲匹地尔阻断血小板激活的效果强于阿司匹林；曲匹地尔组和阿司匹林组干预90 min时血小板抑制率均高于其他两时间点，提示两组抗凝药物90 min时药效高于其他两时间点；各时间点曲匹地尔组血小板抑制率均高于阿司匹林组，提示不同时间点曲匹地尔阻断血小板激活的效果均强于阿司匹林组。

本研究发现，曲匹地尔组、阿司匹林组血小板聚集率均低于生理盐水组，曲匹地尔组血小板聚集率低于阿司匹林组，提示曲匹地尔在糖尿病模型小鼠中抗血小板聚集优于阿司匹林；90、120及150 min时曲匹地尔组血小板抑制率均高于阿司匹林组，阿司匹林对血小板的抑制效果大幅下降,提示曲匹地尔对糖尿病小鼠的血小板抑制效果比阿司匹林更为持久。

综上所述，曲匹地尔抗血小板聚集效果强于阿司匹林，对血小板活化抑制时间更持久，更适合糖尿病合并心血管疾病的治疗。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.010

R285

A

1002-266X(2017)46-0038-03

湖北省肾脏疾病发生与干预重点实验室基金项目(222/222205)；教育部留学生启动资金(46-1)；湖北省重点学科湖北理工学院药学学科资助。

李仲娟(E-mail: 1525677891@qq.com)

2017-04-28)