系膜细胞缺氧损伤后抗增殖蛋白、转化生长因子-β1、α-平滑肌肌动蛋白表达变化

宋坤岭，覃远汉，蒋玲，龚玲，江星伯，余雪云

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

·基础研究·

系膜细胞缺氧损伤后抗增殖蛋白、转化生长因子-β1、α-平滑肌肌动蛋白表达变化

宋坤岭，覃远汉，蒋玲，龚玲，江星伯，余雪云

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

目的观察系膜细胞(MCs)缺氧损伤后抗增殖蛋白(PHB)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化。方法将体外培养的大鼠MCs随机分为模型组和正常组。正常组在常规条件下培养，不做任何处理；模型组置于缺氧小室中(充缺氧气体950 mL/L N2和50 mL/L CO2)密封48 h建立MCs缺氧损伤模型。RT-PCR法检测两组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA mRNA，Western blotting法检测PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA、Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)蛋白。结果模型组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA mRNA相对表达量分别为0.56±0.04、0.51±0.06、1.45±0.11、7.39±1.72，正常组分别为1.0±0.00、1.0±0.00、1.0±0.00、1.0±0.00，两组比较，P均<0.05。模型组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白相对表达量分别为0.47±0.04、0.25±0.02、1.12±0.06、1.35±0.12、0.89±0.07，正常组分别为0.91±0.04、0.56±0.07、0.75±0.05、0.79±0.09、0.52±0.03，两组比较，P均<0.05。模型组PHB1蛋白与TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白表达均呈负相关(r=-0.924、-0.871、-0.840，P均<0.05)，PHB2蛋白与TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白表达均呈负相关(r=-0.928、-0.901、-0.821，P均<0.05)。结论系膜细胞缺氧损伤后PHB表达降低，TGF-β1、α-SMA表达升高，PHB1表达与TGF-β1、α-SMA表达均呈负相关。

系膜细胞损伤；抗增殖蛋白1；抗增殖蛋白2；转化生长因子-β1；α-平滑肌肌动蛋白；Ⅳ型胶原

肾小球硬化(GS)是各种肾小球疾病进展至终末期肾病的共同病理特征，表现为固有细胞异常凋亡、细胞外基质(ECM)大量积聚等。系膜细胞(MCs)为肾脏固有细胞，能够维持肾小球结构、分泌多种因子及调节ECM的代谢平衡[1]。抗增殖蛋白(PHB)是一种高度保守的蛋白质，广泛分布于多种真核生物细胞中，可参与细胞的增殖、分化、衰老、凋亡、生长调控等多种生物学功能，其主要的亚型为PHB1和PHB2。转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种重要的致纤维化因子 ，在肾脏纤维化硬化过程中起重要作用。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是成纤维细胞的标志性蛋白，其表达水平可反映纤维化硬化程度。为了探讨系膜细胞缺氧后PHB、TGF-β1、α-SMA表达变化情况，研究PHB在肾小球硬化之中的作用。本研究通过建立MCs缺氧损伤模型[2]，应用RT-PCR法和Western blotting法检测MCs中PHB、TGF-β1、α-SMA表达变化，并分析其相关性，为防治肾小球硬化提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂 大鼠MCs(HBZY-1)购于上海生物细胞库；低糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；10%胎牛血清(美国Hyclone公司)。

1.2 MCs培养 大鼠MCs(HBZY-1)在低糖DMEM培养基含有10%胎牛血清及1%双抗、37 ℃、50 mL/L CO2条件的培养箱中培养。

1.3 缺氧损伤模型制备及分组 正常细胞在37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养生长至约80%融合时传代，将细胞用胰酶消化成单个细胞，室温下以1 000 r/min离心5 min，后用培养基吹打混匀，然后均匀接种到新的培养瓶之中，待细胞贴壁生长至60%～70%融合之时，更换无血清培养基，将培养的细胞随机分为正常组和模型组。正常组细胞在含5%CO2的培养箱内培养，模型组细胞置于含95%N2和5%CO2混合气体缺氧小室之中培养48 h建立缺氧损伤模型，造模结束后取出缺氧小室内模型组各瓶细胞与培养箱内同时培养的正常组各瓶细胞用于下述实验。

1.4 细胞PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA mRNA检测 造模完成后取两组细胞分别进行细胞总RNA提取，用琼脂糖电泳法选取完整总RNA，以确保能够应用后续实验，测出总RNA浓度。应用反转录试剂盒的标准条件进行RNA的反转录获得cDNA，然后进行RT-PCR实验。引物均由TAKARA公司生产并验证，引物序列：PHB1(175 bp):(F)5′-AAGCAGAGAGAGCCAGATTTGT-3′,(R)5′-TGATAAGCAATGTCCTCAGCAG-3′;PHB2(157 bp):(F)5′-GGCTATATCAAGCTCCGAAAGAT-3′,(R)5′-TCTTACCCTTAATGAGGCTGTCA-3′;TGF-β1(154bp):(F)5′-CGCAATCTATGACAAAACCAAA-3′,(R)5′-TTCTACGTGTTGCTCCACAGTT-3′;α-SMA(182 bp):(F)5′-CACGAAACCACCTATAACAGCA-3′,(R)5′-GTTCTGGAGGAGCAATAATCT-3′;β-actin(207 bp):(F)5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′,(R)5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′；反应体系为20 μL，其中2.5×Real Master Mix/SYBR solution 9.0 μL，PCR Forward Primer 10 μmol /L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，cDNA 1 μL，超纯水9.2 μL。反应条件：PHB1和PHB2均为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，38个循环；TGF-β1为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，进行40个循环；α-SMA为95 ℃预变性4 min，95 ℃变性1 min， 58 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s，28个循环，最后72 ℃保温8 min。每个样本重复3次，取其平均数为样本CT值，设定正常组的基因表达量为1，应用2-ΔΔCt法计算模型组各mRNA的相对表达量，ΔCt=Ct(目的)-Ct(内参)；ΔΔCt=ΔCt(模型组)-ΔCt(对照组)。

1.5 细胞PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA、Ⅳ型胶原

(COL-Ⅳ)蛋白检测 模型制备成功后取模型组和正常组细胞，应用放射免疫沉淀测定(RIPA)蛋白裂解液分别提取两组细胞总蛋白，二喹琳甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。4 ℃、12 000 r/min 离心后吸取上清，按照4∶1比例加入上样缓冲液，煮沸变性后采用Western blotting法检测。所有蛋白上样量每孔均为30 μg，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后按照不同蛋白分子量确定转膜时间，采用湿转法转膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%牛奶封闭液室温下封闭1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，每种蛋白的特异性一抗4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，荧光二抗避光室温下孵育1.5 h，避光TBST洗膜3次，每次5 min，Odyssey红外扫膜仪扫描PVDF膜分析各目的蛋白。测定目的蛋白和内参蛋白条带光密度值(灰度值)，以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值代表蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA mRNA相对表达量比较 结果见表1。

表1 两组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA mRNA相对表达量比较

注：与正常组比较，*P<0.05。

2.2 两组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白相对表达量比较 结果见表2。

表2 两组PHB1、PHB2、TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白相对表达量比较

注：与正常组比较，*P<0.05。

2.3 相关性分析 模型组PHB1蛋白与TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白表达均呈负相关(r=-0.924、-0.871、-0.840，P均<0.05)，PHB2蛋白与TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白表达均呈负相关(r=-0.928、-0.901、-0.821，P均<0.05)。

3 讨论

肾小球主要由内皮细胞、上皮细胞和MCs等3种固有细胞组成，MCs作为主要细胞之一，具有调节肾小球内血流量的作用，且活跃程度最高[3]；当肾小球受到损伤后，MCs作为靶细胞接受外界各种刺激后，出现活性降低、凋亡增加、表型改变以及多种细胞因子分泌和大量ECM积聚。当ECM的代谢失调，过多分泌的ECM积聚在肾小球系膜区，最终导致GS[4]，这是GS发生病理改变之一。

TGF-β1是一种能够在机体内发挥多种调控作用的细胞因子，具有强致纤维化作用，可促进MCs分泌ECM并聚集在肾小球系膜区，在肾脏纤维化和GS中TGF-β1mRNA、蛋白呈高表达状态[5,6]。此外，TGF-β1具有诱导肾脏固有细胞表型转分化作用，同时使转分化细胞表达α-SMA并分泌ECM。

α-SMA作为成纤维细胞的标志性蛋白，正常肾脏中主要在血管平滑肌细胞中表达，病理情况下肾小管上皮细胞和MCs都可转分化并大量表达α-SMA[7]。α-SMA在肾脏不同部位表达高低可间接反映肾脏纤维化硬化的程度，当α-SMA表达增加时表明损伤的靶细胞转分化为成纤维细胞，而成纤维细胞具有强大的ECM分泌能力，分泌的ECM积聚在肾小球系膜区进一步加剧GS[8]。ECM主要成分包括COL-Ⅳ、FN等。

PHB是一种从细菌到哺乳类动物等真核生物中都表达的高度保守、功能广泛的蛋白，主要的亚型为PHB1和PHB2。研究[9]发现，PHB可能参与细胞增殖、分化、凋亡、能量代谢等多种生理过程。PHB在人类和大鼠的肾脏组织均有显著表达，主要定位于肾小管上皮细胞、MCs和间质细胞。PHB在细胞内的细胞核、线粒体和细胞膜之中皆有表达；细胞核中的PHB主要是通过调节转录从而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，细胞膜的PHB参与到信号传导之中，线粒体中的PHB主要通过稳定线粒体内膜，维持线粒体呼吸链的功能，参与细胞能量代谢[10]。Ross等[11]发现，PHB在血液恶性肿瘤中能够稳定线粒体膜和保护细胞。Yang等[12]发现，PHB蛋白在心肌缺血再灌注损伤及心肌细胞氧化损伤时呈高表达，其表达增加可能为心肌细胞内源性抗损伤作用的代偿性反应。Dong等[13]认为，PHB在2型糖尿病大鼠病变心肌组织中表达下降，PHB过表达能够改善糖尿病心肌病的心功能。我们的前期研究[14]显示，肾间质纤维化大鼠肾脏PHB表达显著下降可能与PHB抗氧化损伤有关。

本研究显示，与正常组比较，模型组MCs出现胞体明显萎缩，活性明显下降，凋亡显著增多，提示MCs缺氧损伤模型成功建立。模型组MCs的PHB1和PHB2的mRNA、蛋白表达均降低，而TGF-β1和α-SMA的mRNA和蛋白以及COL-Ⅳ的蛋白表达升高，并且PHB1和PHB2的蛋白表达与TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅳ的蛋白表达均呈显著负相关。结果表明，系膜细胞缺氧损伤后细胞活性降低、凋亡增多，同时TGF-β1、α-SMA表达升高，导致细胞外基质分泌增加，表明系膜细胞在缺氧损伤后出现了肾小球硬化病理改变；同时PHB表达显著降低，提示PHB的表达降低与肾小球硬化病理过程有紧密联系。其机制可能与缺氧损伤后MCs中PHB1、PHB2表达降低引起TGF-β1、α-SMA表达升高，导致ECM积聚增加，使细胞凋亡增多及细胞活性降低进一步有关。但PHB的表达降低参与到肾小球硬化病理进展之中的具体分子机制有待于进一步探讨。

[1] Abboud HE. Mesangial cell biology[J]. Exp Cell Res, 2012,318(9):979-985.

[2] 吴传亮,张许.缺氧模型的制造与评价[J].社区医学杂志,2013,11(7):10-12.

[3] Kurihara H, Sakai T. Cell biology of mesangial cells: the third cell that maintains the glomerular capillary[J]. Anat Sci Int, 2017,92(2):173-186.

[4] 吕高虹,许惠琴,秦佩佩,等.高糖对人肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(5):1066-1067.

[5] Budi EH, Duan D, Derynck R. Transforming growth factor-β Receptors and smads: regulatory complexity and functional versatility[J]. Trends Cell Biol, 2017,27(9):658-672.

[6] Ding Y, Choi ME. Regulation of autophagy by TGF-β: emerging role in kidney fibrosis[J]. Semin Nephrol, 2014,34(1):62-71.

[7] 胡鹏,覃远汉,经承学.转化生长因子-β与肾脏固有细胞表型转分化[J].中华实用儿科临床杂志,2008,23(5):385-387.

[8] 易著文,陈丹.肾小管上皮细胞损伤在肾小管间质纤维化中的作用[J].中华实用儿科临床杂志,2007,22(17):1287-1289.

[9] Chowdhury I, Thomas K, Thompson WE. Prohibitin(PHB) roles in granulosa cell physiology[J] Cell Tissue Res, 2016,363(1):19-29.

[10] Peng YT, Chen P, Ouyang RY, et al. Multifaceted role of prohibitin in cell survival and apoptosis[J]. Apoptosis, 2015,20(9):1135-1149.

[11] Ross JA, Robles-Escajeda E, Oaxaca DM, et al. The prohibitin protein complex promotes mitochondrial stabilization and cell survival in hematologic malignancies[J].Oncotarget, 2017,39(8):65445-65456.

[12] Yang P, Jia YH, Li J, et al. Study of anti-myocardial cell oxidative stress action and effect of tanshinone ⅡA on prohibitin expression[J]. J Tradit Chin Med， 2010,30(4):259-264.

[13] Dong WQ, Chao M, Lu QH, et al. Prohibitin overexpression improves myocardial function in diabetic cardiomyopathy[J]. Oncotarget, 2016,7(1):66-80.

[14] Zhou TB, Qin YH. Prohibitin 1 expression is associated with prohibitin 2 expression in renal interstitial fibrosis rats[J]. Ren Fail, 2013,35(10):1465.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.008

R692.6

A

1002-266X(2017)47-0028-03

广西高等学校高水平“创新团队及卓越学者计划”资助项目；广西医学高层次骨干人才培养“139”计划资助项目。

覃远汉(E-mail: qinyuanhan603@163.com)

2017-08-07)