口腔鳞状细胞癌组织miRNA-222表达及其意义

许云，高彤彤

(1南昌市中西医结合医院，南昌330003；2江苏开放大学)

口腔鳞状细胞癌组织miRNA-222表达及其意义

许云1，高彤彤2

(1南昌市中西医结合医院，南昌330003；2江苏开放大学)

目的探讨口腔鳞状细胞癌组织中微小RNA-222(miRNA-222)表达变化及其临床意义。方法收集86例口腔鳞状细胞癌患者的肿瘤组织标本为观察组，30例口腔良性肿瘤患者的正常口腔黏膜组织标本为对照组。采用实时荧光定量PCR法检测两组miRNA-222表达，分析口鳞状细胞癌组织miRNA-222表达与患者临床病理参数的关系。结果观察组、对照组miRNA-222相对表达量分别为2.854±0.172、0.765±0.113，两组比较P<0.05。观察组肿瘤直径>3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中miRNA-222相对表达量分别高于肿瘤直径≤3 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移患者肿瘤组织(P均<0.05)。结论口腔鳞状细胞癌组织中miRNA-222表达升高，检测miRNA-222表达变化有助于口腔鳞状细胞癌的诊断和病情判断。

口腔鳞状细胞癌；微小RNA；微小RNA-222

口腔鳞状细胞癌约占口腔癌的80%，具有发病率高、侵袭性高、患者预后差等特点[1～3]。微小RNA(miRNA)是一类单链小分子非编码RNA，其可与靶基因序列通过互补配对的方式特异性结合，具有抑癌或促癌功能，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[4,5]。miRNA-222是位于X染色体上miRNA家族成员之一，研究证实其参与了胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发病过程，并与患者预后密切相关[6,7]。目前，miRNA-222与口腔鳞状细胞癌的关系尚不明确。本研究观察了口腔鳞状细胞癌组织中miRNA-222表达变化，并分析其与口腔鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年8月～2017年5月南昌市中西医结合医院收治的86例口腔鳞状细胞癌患者的肿瘤组织标本(观察组)。纳入标准：①手术切除并经病理检查证实为原发性口腔鳞状细胞癌；②术前未接受过任何放、化疗，也未接受过激素治疗；③肿瘤原发灶保存良好。排除标准：①妊娠期及哺乳期女性；②心功能不全；③肝、肾功能障碍；④其他类型恶性肿瘤。患者男51例，女35例；年龄37～69(49.3±5.5)岁，其中<60岁56例，≥60岁30例；舌癌54例，颊癌32例；TNM临床分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期47例；中高分化33例，低分化53例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移46例。选取同期30例因良性肿瘤行手术切除患者的正常口腔黏膜组织为对照组，患者男19例、女11例，年龄38～69(48.0±5.9)岁。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 miRNA-222表达检测 采用实时荧光定量PCR法。采用组织miRNA快速提取试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)提取两组标本的总RNA，提取过程严格按照试剂盒说明操作。采用紫外分光光度计对所得RNA浓度及纯度进行测定，A260/A280为1.8～2.1表明纯度较好。采用TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(美国Life Technologies公司)合成cDNA。总反应体系为25 μL，包括2 μL总RNA，1 μL 2.5 U/μL Poly A Polymerase，1 μL RTase Mix，5 μL 5XPAP/RT buffer，最后加入ddH2O定容至25 μL。反应条件为37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。将得到的cDNA产物置于-20 ℃环境中保存。miRNA-222引物上游序列为5′-CGCAGATCTTTTCT-TCCACAGA-3′，下游序列为5′-GGGGATCCTCTCAGGACACTGAAGC-3′，扩增片段长度为155 bp。内参为U6基因。U6引物上游序列为5′-CTCGCTTCGGAGCACA-3′，下游序列为5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAA-3′，扩增片段长度为96 bp。反应体系为20 μL，其中包括10 μL 2× All-in-One qPCR Mix，2 μL Universal Adaptor PCR Primer，2 μL All-in-One miRNA qPCR Primer，2 μL cDNA，4 μL ddH2O。反应条件为95 ℃ 10 s预变性，95 ℃ 3 s变性，80 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，变性至延伸这个过程共计循环40次。采用2-ΔΔCt表示miRNA-222相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。分析口腔鳞状细胞癌组织miRNA-222表达与患者临床病理参数的关系。

2 结果

观察组、对照组miRNA-222相对表达量分别为2.854±0.172、0.765±0.113，两组比较P<0.05。肿瘤直径>3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌患者肿瘤组织miRNA-222相对表达量分别高于肿瘤直径≤3 cm、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移患者肿瘤组织(P均<0.05)。见表1。

表1 口腔鳞状细胞癌组织miRNA-222表达量与患者临床病理参数的关系

3 讨论

口腔癌病情进展迅速，早期即可转移至区域淋巴结，晚期易发生远处转移，局部切除联合术后放、化疗为其主要治疗方法，但患者术后复发转移率较高，5年生存率仅60%[8，9]。

miRNA是一类调控基因表达的单链小分子非编码RNA，约为22个核苷酸，通过识别特定的mRNA并转录，可使靶mRNA降解，或者对其翻译过程产生抑制作用，在基因的表达过程中发挥调控功能[10]。研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中，miRNA具有抑癌或促癌基因的作用，其异常表达可参与信号激活、细胞增殖和分化、血管形成和侵袭转移等生物学过程[11]。张竹青等[5]研究发现，miRNA-222通过介导转录后基因表达参与肝癌细胞的增殖、分化、凋亡、转移等过程。韩福新等[12]报道，miRNA-21、miRNA-221、miRNA-222在脑胶质瘤发病中发挥重要作用，可作为脑胶质瘤早期诊断和患者预后评估的重要指标。姜训圳等[13]发现，miRNA-21、miRNA-135b、miRNA-141过高表达参与了结肠癌的发病过程，并且与肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移密切相关。口腔鳞状细胞癌组织中也存在不同程度的miRNA异常表达，这些miRNA参与肿瘤的生长、浸润和转移过程。王远财等[2]研究证实，miRNA-149表达下调参与口腔鳞状细胞癌的发病过程，并且与肿瘤的病理分级、转移密切相关，可作为评估口腔鳞状细胞癌临床分期的肿瘤标志物。此外，Li 等[14]研究发现，miRNA-21在口腔鳞状细胞癌组织中表达上调，且与患者预后密切相关，miRNA-21表达越高，患者预后越差、术后5年生存率越低。

miRNA-222定位于染色体Xp11.3，作为促癌因子在肝细胞癌[15]、膀胱癌[16]等肿瘤组织中表达异常。本研究结果显示，观察组miRNA-222相对表达量高于对照组。提示miRNA-222表达上调可能参与口腔鳞状细胞癌的发生，可将其作为诊断口腔鳞状细胞癌的辅助指标。本研究发现，肿瘤直径>3 cm、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移的口腔鳞状癌细胞组织中miRNA-222相对表达量相对较高。miRNA-222表达水平越高，口腔鳞状细胞癌恶性程度越高，同时也越容易出现远处淋巴结转移，患者预后也越差。提示miRNA-222可作为评估口腔鳞状细胞癌病情的肿瘤标志物。

综上所述，miRNA-222在口腔鳞状细胞癌中表达上调。miRNA-222可能参与了口腔鳞状细胞癌的发生、发展过程。早期检测miRNA-222有助于口腔鳞状细胞癌的辅助诊断及病情评估。

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