比格犬源芽孢杆菌对小鼠体重和组织脏器的影响

林 康，刘国庆，李 炼，刘洪成，刘 慧，温建新

（1. 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2. 青岛市西海岸新区动物疫病预防与控制中心，山东青岛 266000；3. 青岛西海岸新区兽药饲料稽查所，山东青岛 266400）

比格犬源芽孢杆菌对小鼠体重和组织脏器的影响

林 康1，刘国庆2，李 炼1，刘洪成3，刘 慧1，温建新1

（1. 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2. 青岛市西海岸新区动物疫病预防与控制中心，山东青岛 266000；3. 青岛西海岸新区兽药饲料稽查所，山东青岛 266400）

为验证比格犬源芽孢杆菌的安全性，以小鼠为试验动物，研究该菌对小鼠体重和组织脏器的影响。将40只30日龄SPF级小白鼠（雌雄各20只）随机分为4组，每组10只。对照组饲喂普通日粮；试验组在饲喂普通日粮的基础上，每只灌服0.2 mL比格犬源芽孢杆菌菌液（109cfu/mL）；每隔2 d测定体重；18 d后，将小鼠脱臼处死，取脾脏、肾脏称重；将肝脏、十二指肠、空肠和回肠用福尔马林固定，做组织切片试验。结果显示：试验组与对照组小鼠的体重差异不显著（P＞0.05）；试验组小鼠肾脏重量有增加，肾脏指数与对照组相比，有显著性差异（P＜0.05）；试验组公鼠脾脏重量增加明显，与对照组相比，差异极显著（P＜0.01）；试验组小鼠肠绒毛较发达，肝小叶结构清晰，肝窦和门管区明显可见。试验证明，比格犬源芽孢杆菌对小鼠十二指肠、空肠、回肠和肝脏的正常结构未造成危害，说明比格犬源芽孢杆菌是安全可用的，且对组织脏器有一定的促生长作用。

比格犬；芽孢杆菌；小鼠体重；组织脏器

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物。其作用原理是通过与动物消化道内其他微生物菌体的竞争和排斥，将肠道内微生物数量维持在一个动态平衡，从而促进肠道发育，提高动物自身免疫力和饲料利用率[1]。

除炭疽芽孢杆菌外，芽孢杆菌多属于益生菌，属于革兰氏阳性菌，能够分泌蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、纤维素酶等酶类，提高动物消化和利用营养物质的能力[2]。以前的研究结果大多把芽孢杆菌作为过路菌[3]。近几年来，一些最新的报告及研究结果指出有些芽孢杆菌可以黏附定殖。由于芽孢杆菌大多为好氧菌，能够消耗动物胃肠道内大量氧气，从而降低了肠道内氧浓度，使肠道内处形成一个厌氧环境，消耗动物肠道内大量氧气，导致肠道内有害菌或外来菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等的数量明显减少，同时改善其他厌氧益生菌，如乳酸杆菌的生长环境，保持肠道菌群数量和结构的平衡，进而提升动物自身免疫力，相应减少胃肠道疾病出现的概率[4]。芽孢杆菌通过对有益厌氧菌的增殖和对有害致病菌的抑制，使肠道中原本失调的各菌群得以平衡，因而加强了动物免疫力和疾病抵制力，有利于动物保持健康姿态。研究表明，在日粮中添加适量芽孢杆菌，可以促进肉鸡、水貂、青鱼等动物的肠道发育，从而提高肠道免疫功能，最终改善生产性能[5-8]。本试验应用青岛农业大学山东省预防兽医重点实验室分离自比格犬的芽孢杆菌，对小鼠进行体重和组织脏器影响试验，从而为犬专用芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种 比格犬源芽孢杆菌是从比格犬新鲜粪便中提取的，在实验室经过分离、纯化和培养获得的原始菌种，由青岛农业大学山东省预防兽医重点实验室分离保存。

1.1.2培养基肉汤琼脂培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏15 g、NaCl 15 g、蒸馏水1 000 mL、琼脂18 g。调节pH为7.2，20 min高压灭菌。

1.2 方法

1.2.1耐受性试验 为保证该菌能够适应小鼠肠道内各种理化环境，在试验之前进行一系列耐受性试验，如耐胃液、耐胆盐、耐热试验。

1.2.1.1耐胃液试验 用PBS缓冲溶液配置液体培养基，用37% HCl 溶液和胃蛋白酶制备人工胃液，除菌备用，测其OD600值；将新鲜增值好的菌液接种于人工胃液中，培养150 min，每隔30 min取1次样品，测定其OD600值。

1.2.1.2耐胆盐试验 配制不同浓度（0.0%、0.1%、0.2%和0.3%）的人工胆盐，除菌；加入新鲜菌液，置于37 ℃恒温培养箱中，每隔1 h取样品，共培养3 h；用培养基进行平板计数，重复3次，求其平均值。

1.2.1.3耐热试验 将新鲜菌液分别置于不同温度（37、40、50、60、70 ℃） 中 2、6、10 min；每组做3个平行，分别进行平板计数。

1.2.2动物试验分组及管理 选取30日龄SPF级别小鼠40只（雌雄各半），随机分成4组，每组各10只，雌雄分开饲养。设2个对照组、2个试验组。对照组饲喂普通日粮，试验组在普通日粮基础上，灌喂0.2 mL/只的芽孢杆菌菌液（109cfu/mL），饲喂期18 d。分别在试验中期（9 d）和结束后（18 d），对所有小鼠集中称重，算出小鼠平均体重，然后将结果与试验前数据进行对比分析。为了检测小鼠的发育状况，从第2天开始，采用红外线测温仪，每隔2 d对小鼠进行逐个测温。每次测温时，保证枪头与小鼠的直线距离相等。具体动物分组见表1。

1.2.3小鼠解剖试验 饲喂期结束后，将小鼠脱臼处死。用酒精喷雾，将老鼠腹侧毛打湿，用手术剪，对每只小鼠进行T字形开膛，然后立即拍照，对内脏器官形态进行对比分析。

表1 动物分组

1.2.4脏器质量测定试验 拍照后，立即分离肝脏、脾脏、肾脏，用注射器抽取适量生理盐水进行缓慢冲洗，再用滤纸吸干，最后称重、记录。

1.2.5动物组织切片试验 对肝脏、十二指肠、空回肠、盲肠和直肠，用手术剪取样，浸泡固定在装有40%福尔马林溶液的10 mL离心管中，并写清编号；采用苏木精-伊红染色法（HE染色）染色，中性树脂封片晾干，显微镜下观察结果。

1.3 数据分析

用SPSS17.0软件进行差异显著性分析（P＜0.05），将结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 耐受性试验

比格犬源芽孢杆菌对胃液的耐受结果显示，2.5 h后的存活率均在71%以上；对胆盐的耐受性结果显示，0.3%的胆盐浓度下，2.5 h后的存活率均保持在65%以上；对温度的耐受性结果显示，在80 ℃时依旧可以生长，且存活率在69%以上。

2.2 小鼠体重、体温测定

饲养期间，小鼠被毛光滑干净，进食和饮水均正常，未出现腹泻、疾病，体温变化相对平稳（图1）。试验前后各组小鼠的平均体重无显著性差异（P＞0.05，表 2）。

图1 小鼠体温变化折线图

表2 芽孢杆菌对小鼠体重的影响

2.3 小鼠解剖试验

为进一步测定比格犬源芽孢杆菌对小鼠不同组织和脏器的影响，在饲喂期结束后，对小鼠脱臼处死，剖检发现试验组小鼠的内脏表面相对光滑，部分器官体积相对增大，十二指肠、空回肠以及直肠和盲肠表面湿润光滑，富有弹性（图2）。

图2 对照组和试验组小鼠剖检结果对比

2.4 组织脏器指数测定

母鼠肾脏指数与对照组相比有显著性差异（0.01＜P＜0.05），公鼠与对照组相比有极显著性差异（P＜0.01）。母鼠脾脏指数与对照组相比差异不显著（P＞0.05），公鼠与对照组相比有极显著性差异（P＜0.01）。脾脏和肾脏重量、肾脏指数和脾脏指数，以及它们的平均增重见图3。

图3 芽孢杆菌对小鼠肾、脾的影响

2.5 动物组织切片试验

显微镜下，小鼠肠绒毛发达，绒毛以固有膜为中心，单层柱状上皮清晰，平滑肌明显（图4、图5）；肝脏表面无明显水肿，肝小叶结构清晰，肝窦和门管区明显（图6）。

图4 空、回肠段（X100，HE染色）

图5 十二指肠（X100，HE染色）

图6 肝脏（X100，HE染色）

3 讨论

3.1 对小鼠体重的影响

试验组小鼠与对照组相比，体重差异并不显著。这可能因为该芽胞杆菌不是鼠专用芽孢杆菌，对小鼠体重的影响不很明显。该芽胞杆菌是否对试验犬有明显增重作用，有待于进一步试验。小鼠体温恒定，被毛相对光滑，精神状态较好，说明比格犬源芽孢杆菌对小鼠生命健康无明显影响，从而证明该犬源芽孢杆菌是安全可用的。

3.2 对小鼠各肠段的影响

试验组小鼠各脏器和肠段表面湿润光滑、富有弹性，说明芽孢杆菌对动物肠道发育具有积极影响。这与仝永娟等[9]得出的结论一致。研究表明，芽孢杆菌制剂可有效增加小肠中各种抗体水平，从而提高机体粘膜免疫力[10]。枯草芽孢杆菌可释放具有修复作用的因子，及时修复肠道粘膜，增强小鼠肠道免疫功能[11-12]。

3.3 对小鼠不同脏器的影响

该株芽孢杆菌可能对小鼠肾脏和公鼠脾脏有促进作用。试验组雌鼠的脾脏重量与对照组相比不显著，而公鼠与对照组相比显著。这与黄琴[9]的试验结果一致。该芽孢杆菌对雌雄小鼠脾脏指数的增长影响一致，因此其影响与菌的来源和性别因素有关。这与祝小[13]得出的试验结果不一致，有待进一步研究确定。

[1] 郭本恒. 益生菌[M]. 北京：化学工业出版社，2004：1-2.

[2] 李春凤，林显华，谷巍. 枯草芽孢杆菌在饲料生产及环境防治中的应用[J]. 中国饲料，2013（1）：10-12.

[3] 王振华，潘康成. 不同浓度中药对枯草芽孢杆菌体外生长的影响[J]. 中国兽医杂志，2007（10）：44-45.

[4] 邱雪兴，骆宏机，刘文聪. 芽孢杆菌在动物营养与饲料中的应用[J].中国畜牧兽医文摘，2014（5）：194-195.

[5] 范薇. 实验小鼠肠道正常菌群[J]. 中国比较医学杂志，2004（1）：57-59.

[6] 刘明超，金融，徐雪梅，等. 芽孢杆菌对肉鸡生产性能、免疫功能及肠道发育的影响[J]. 中国饲料，2015（23）：18-20.

[7] 沈斌乾，陈建明，郭建林，等. 饲料中添加枯草芽孢杆菌对青鱼生长、消化酶活性和鱼体组成的影响[J]. 水生生物学报，2013（1）：48-53.

[8] 屈平平，李涛，姜八一. 芽孢杆菌制剂在水貂养殖中的应用前景[J]. 山东畜牧兽医，2015（10）：59-61.

[9] 仝永娟，萨仁娜，张宏福，等. 三株芽孢杆菌抑菌活性分析及对肉鸡舍空气微生物的影响[J]. 中国农业科学，2013（20）：4344-4353.

[10] 杨慧. 芽孢杆菌制剂对小鼠小肠粘膜结构及粘膜免疫的影响研究[D]. 成都：四川农业大学，2007.

[11] 马冬梅. 枯草芽孢杆菌对菌群失调小鼠肠道肠三叶因子表达的影响[D]. 武汉：华中农业大学，2010.

[12] 黄琴. 芽孢杆菌影响Caco-2、RAW264.7细胞及小鼠免疫功能的研究[D]. 杭州：浙江大学，2012.

[13] 祝小. 芽孢杆菌制剂对小鼠下丘脑—垂体—肾上腺—免疫器官的影响[D]. 成都：四川农业大学，2007.

Effects of Beagle's Bacillus on Weight，Tissues and Organs in Mice

Lin Kang1，Liu Guoqing2，Li Lian1，Liu Hongcheng3，Liu Hui1，Wen Jianxin1

（1. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China；2. West Coast New Area Animal Disease Prevention and Control Center of Qingdao City，Qingdao，Shandong 266000，China；3. West Coast New Area Veterinary Drug and Feed Inspection Institution，Qingdao，Shandong 266400，China）

In order to investigate the security of Beagle's Bacillus，taking mice as experimental animals，the effect on weight，tissues and organs in mice was studied. The 40 SPF mice（20 males and 20 females）aged 30 days were divided into 4 groups randomly（10 mice in each group）. The control group was fed with normal diet，the experimental group was fed of 0.2 mL Beagle's Bacillus（109cfu/mL）on the basis of normal diet. The weight was measured every two days，and 18 days later，all mice were killed by dislocation. The liver，spleen and kidney were taken and weighed. The duodenum，jejunum，and ileum were fixed with formalin and were subjected to histological examination. The results showed that the difference of body weight between the test group and the control group was not significant（P＞0.05）. The kidney weight of the mice in the test group was increased，and the renal index was significantly different from that of the control group（P＜0.05）. The spleen of male rats increased significantly，and the difference was extremely significant（P＜0.01）compared with the control group. The intestinal villus of the experimental group was more developed，the structure of the hepatic lobule was clear，and the hepatic sinus and the portal area were obviously visible. This test proved that Bacillus did not cause harm to the normal structure of the duodenum，jejunum，ileum and liver. The Bacillus was safe and available，and could promote the growth of tissues and organs.

Beagle；Bacillus；mice weight；tissues and organs

S851.3

B

1005-944X（2018）01-0091-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.025

山东省现代农业特种经济动物产业创新团队资金（SDAIT-21-13）；青岛市科技计划项目（15-9-2-108-nsh）；山东省高等学校优势学科人才团队培育计划

同等贡献作者：林 康、刘国庆

温建新

朱迪国）