猪δ冠状病毒病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，杨丽梅，李 峰

（1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2. 滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州 256600）

猪δ冠状病毒病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋1，2，梅建国1，2，张 颖1，杨丽梅1，李 峰1

（1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2. 滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州 256600）

猪δ冠状病毒是近年来新发现的一种能够引起猪只严重水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪死亡的猪肠道冠状病毒。该病的传播给养猪业带来了严重的经济损失。为了解该病毒的研究进展情况，本文综述了该病毒的由来、分类、形态、基因组结构和功能、培养特性和致病性等特性，介绍了其检测技术的相关研究进展，包括病毒的分离培养、血清学检测技术，以及分子生物学检测技术（包括RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术）等，以期为诊断和防控猪δ冠状病毒病提供参考。

猪δ冠状病毒；病原学特征；检测；RT-PCR

猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是近年来新发现的一种能够引起猪只严重水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪死亡的猪肠道冠状病毒。该病毒导致的临床症状及病理变化与猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等非常相似，临床上较难区分，若不加以预防和控制，会给养猪业造成重大损失。本文对PDCoV的发现、病原学特征、培养特性及检测技术研究进展等方面进行了综述，以期为更好地诊断和防控该病提供参考。

1 由来和发现

PDCoV最早于2012年由香港研究人员在鉴定哺乳动物与禽类的新冠状病毒时被发现，于2014年在美国腹泻仔猪和母猪的粪便中首次被成功检测并分离，随后陆续在加拿大、韩国和泰国等国家被检出[1]。Dong等[2]对2013—2014年间采自我国湖北、江苏、广东、河南和安徽等省份规模化猪场的258份粪便样品进行检测，共检测到21份阳性样品，阳性率为14.3%，首次证实PDCoV在我国猪场中存在。

2 分类地位

PDCoV属于冠状病毒科δ冠状病毒属成员。冠状病毒科分为α、β、γ和δ 4个冠状病毒属。α和β冠状病毒属主要由哺乳动物冠状病毒组成，γ冠状病毒属主要包括鸟类冠状病毒，而δ冠状病毒属既包括哺乳动物冠状病毒，也包括鸟类冠状病毒[3]。PEDV和TGEV均属于α冠状病毒属。δ冠状病毒属最初只在禽类体内被发现。

3 病原学特征

3.1 形态特征

PDCoV病毒粒子结构与其他冠状病毒相似，呈典型的冠状病毒形态。电镜观察显示，PDCoV病毒粒子呈球形，直径约120～180 nm，具有囊膜和纤突。

3.2 基因组结构及功能

PDCoV为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组结构与PEDV相似，全长约为25.4 kb，是目前已知冠状病毒家族中基因组长度最小的病毒。PDCoV具有5´端帽子结构和3´端Poly（A）尾巴，共编码4种结构蛋白（纤突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N）和4种非结构蛋白[1]。N蛋白是冠状病毒中一种多功能磷酸化结构蛋白，是冠状病毒在感染细胞中产生最多的病毒蛋白之一，其结构具有保守性和种属特异性，可用于建立高效、准确和快速的分子生物学检测技术。S蛋白是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点。E蛋白较小，是负责病毒与包膜结合的蛋白。M蛋白负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。

3.3 培养特性

Hu等[4]对PDCoV分离及细胞适应性进行了较为详细的研究，发现PDCoV可以在猪睾丸细胞（ST）和猪肾小管上皮细胞（LLC-PK）上生长与传代，并产生明显的细胞病变（CPE），表现为细胞变圆和聚集，最后脱落。在病毒分离和培养过程中，需要添加胰酶、胰液素或未感染仔猪的小肠内容物（SIC）。若培养基不加胰酶处理，病毒仍能在LLC-PK细胞上复制和生长，但不会产生CPE，且病毒滴度较低。胰酶或SIC是病毒培养过程中非常重要的因素，可影响病毒与受体结合、病毒进入细胞或者复制的某个阶段，从而促进病毒复制以及CPE的产生。这表明PDCoV与PEDV在病毒入侵细胞以及病毒复制过程中有相似的机制。

4 致病性

PDCoV是猪的一种肠道疾病病原。尽管病毒感染仔猪后出现腹泻和脱水，但其食欲一般不受影响，且体温保持正常。PDCoV主要感染部位在小肠上皮细胞，剖检可见小肠上皮损伤和肠绒毛脱落等病变。这与PEDV和TGEV感染仔猪的剖检变化极为相似。

5 病毒检测技术

5.1 分离培养

目前，PDCoV的分离培养主要采用LLCPK和ST细胞。陈建飞等[5]对黑龙江省某猪场的PDCoV阳性样品无菌处理后，接种LLC-PK细胞并连续传代培养，成功分离到我国首株PDCoV，并将其命名为NH株。M基因的系统发育分析表明，NH株与美国及韩国的PDCoV亲源关系较近。

5.2 血清学检测技术

5.2.1ELISA Ma等[6]以PDCoV全病毒作为包被抗原，建立了间接ELISA方法。Thachil等[7]建立了以原核表达纯化的PDCoV S蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。通过对已知210份血清样本进行PDCoV抗体检测，得出该法敏感性和特异性分别为90.6%和94.8%。对355份血清样品进行检测，阳性率为8.7%。张帆帆等[8]、苏明俊[9]和逄凤娇等[10]先后建立了以原核表达的PDCoV N蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法，并应用建立的方法进行了大量血清学检测，表明我国不同地区猪群中都存在PDCoV感染，为PDCoV的流行病学调查及防控提供了重要依据。

5.2.2其他血清学方法 Chen等[11]、Hu等[4]和Okda等[12]先后应用间接免疫荧光法（IFA），在PDCoV病毒分离过程中检测培养细胞中是否存在病毒。Chen等[11]以兔抗PDCoV M、N和S蛋白抗体作为一抗，建立了PDCoV组织免疫化学分析法（IHC），并利用该法分析了PDCoV感染的猪的组织，结果发现PDCoV主要集中在空肠中段、末端及回肠部位，说明PDCoV对此部位较为敏感，为PDCoV的临床诊断、组织分布，以及致病机理研究奠定了基础。Jung等[13]建立的原位杂交（ISH）和免疫荧光染色法，对PDCoV感染猪后在组织中的复制位点进行了测定，发现PDCoV在猪的整个肠道均可引起急性感染，但病毒最先在空肠和回肠部位复制。Okda等[12]采用建立的ELISA和荧光微球免疫检测法（FMIA）方法，对PDCoV感染猪的血清抗体动力学进行了初步研究，实验室感染条件下，2种方法的检测结果均表明PDCoV血清抗体转换发生在感染后8～14 d。

5.3 分子生物学检测技术

5.3.1RT-PCR技术 目前已建立的PDCoV特异性RT-PCR，都是针对M或N基因保守区域的。在PDCoV流行初期，Wang等[14]以香港株PDCoV HKU15-155的M和N基因为靶基因，设计了特异性引物，建立了RT-PCR方法，首次确定美国出现了PDCoV。Sinha等[15]采用RT-PCR方法，对来自美国18个州的1 734份样本进行检测，证明最晚于2013年8月美国已经出现了PDCoV。逄凤娇等[16]根据PDCoV M基因建立的RT-PCR方法的最低检测限达6.33×104拷贝/µL。郑丽等[17]根据PDCoV M基因建立了RT-PCR方法，对110份临床样品进行检测，发现阳性检出率为11.8%。张帆帆等[18]根据PDCoV N基因建立了RT-PCR方法，最低能检测到1.0×103拷贝/µL。陈建飞等[5]根据PDCoV E和M蛋白基因设计引物建立了RTPCR方法，对2014年1月至2015年11月收集的77个猪场的232份临床腹泻样品进行了RT-PCR检测，发现PDCoV阳性率达10.3%（24/232）。Song等[19]以PDCoV N基因为靶基因建立了巢式RT-PCR方法，对2012年11月至2015年3月在江西采集的356份猪粪便或肠道样本进行检测，发现PDCoV阳性样品高达33.7%，PDCoV与PEDV共同感染率为19.7%。由于PDCoV与PEDV引起的临床症状极为相似，在普通实验室很难进行准确诊断，因此建立针对2种病毒的诊断方法是非常必要的。Zhang等[20]在传统RT-PCR方法的基础上，以PDCoV和PEDV的M基因为靶基因，建立了一种针对PDCoV和PEDV的双重RT-PCR，检出对PEDV的检测限为7个RNA拷贝，对PDCoV的检测限为14个RNA拷贝。刘玲玲等[21]根据PDCoV N基因和TGEV N基因序列设计引物建立了能同时检测PDCoV和TGEV的双重RT-PCR方法，对252份临床样品进行检测，检出PDCoV阳性样品31份，阳性率为12.3%，TGEV阳性样品12份，阳性率为4.8%，同时感染PDCoV和TGEV的阳性样品2份，阳性率为0.8%。韩丽等[22]根据PDCoV N基因和PEDV M基因序列设计引物，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR方法，对111份临床样品进行检测，其中PDCoV阳性样品22份，阳性率为19.8%，PEDV阳性样品27份，阳性率为24.3%，PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份，阳性率为9.0%。任玉鹏等[23]建立了同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法，对222份腹泻样品进行检测，发现PEDV、PDCoV和TGEV的阳性检出率分别为52.2%、2.7%和2.3%。双重或多重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV、PEDV和TGEV等单一或混合感染的临床样品进行快速检测，为临床上猪病毒性腹泻的鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。

5.3.2荧光定量RT-PCR技术 实时荧光定量RTPCR比常规RT-PCR更具优势，在PDCoV检测方面也取得了进展。Marthaler等[24]针对PDCoV的ORF1、S1和M基因设计引物并建立了TaqMan荧光定量RT-PCR方法，发现M基因引物灵敏度高且稳定性好。Chen等[11]和Zhang等[20]也先后针对PDCoV的M基因建立了TaqMan荧光定量RTPCR检测方法。张利卫等[25]根据PDCoV M基因序列设计引物，建立了PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，对198份临床腹泻样品进行检测，发现阳性率为20.7%（41/198）。Ma等[6]和肖帅等[26]先后根据PDCoV N基因设计引物，建立了PDCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该法能在猪发病早期或病毒隐性感染时进行确诊和实时监测，不仅可以应用于PDCoV流行病学调查，也将为PDCoV的定量检测和快速诊断提供有力的技术手段。

6 小结

PDCoV的传播给世界养猪业带来了严重的经济损失，引起了人们的关注。目前尚无针对PDCoV的商品化疫苗、特效治疗药物或防治方法，人们对PDCoV的认识也较少，与其他引起腹泻的病毒相比，PDCoV的诊断和检测工具尚处于起步阶段。但随着人们对PDCoV研究的不断深入，尤其是对其致病机制和免疫机理的深入了解，相信PDCoV疫苗和更加简便、有效的检测技术会相继发展和成熟，以控制该病的发生与流行。

[1] 龙云凤，王毅谦，姜珊，等. 猪δ冠状病毒检测方法研究进展[J]. 畜牧与兽医，2017，49（3）：116-121.

[2] DONG N，FANG L，ZENG S，et al. Porcine deltacoronavirus in mainland China[J]. Emerging infectious diseases，2015，21（12）：2254-2255.

[3] 方谱县，方六荣，董楠，等. 猪δ冠状病毒的研究进展[J]. 病毒学报，2016，32（2）：243-248.

[4] HU H，JUNG K，VLASOVA A N，et al. Isolation and characterization of porcine deltacoronavirus from pigs with diarrhea in the United States[J]. Journal of clinical microbiology，2015（53）：1537-1548.

[5] 陈建飞，王潇博，焦贺勋，等. 国内首株猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus）的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报，2016，38（3）：171-174.

[6] MA Y M，ZHANG Y，LIANG X Y，et al. Origin，evolution，and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States[J]. Mbio，2015，6（2）：64.

[7] THACHIL A，GERBER P F，XIAO C，et al. Development and application of an ELISA for the detection of porcine deltacoronavirus IgG Antibodies[J]. Plos one，2015，10（4）：1243-1263.

[8] 张帆帆，宋德平，郭楠楠，等. 以原核表达的猪δ冠状病毒N蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2016，38（10）：795-799.

[9] 苏明俊. 猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价[D]. 大庆：黑龙江八一农垦大学，2017.

[10] 逄凤娇，俞正玉，何孔旺，等. 猪丁型冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2017，39（6）：461-465.

[11] CHEN Q，GAUGER P，STAFNE M，et al.Pathogenicity and pathogenesis of a United States porcine deltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old neonatal piglets[J]. Virology，2015（482）：51-59.

[12] OKDA F，LAWSON S，LIU X D，et al. Development of monoclonal antibodies and serological assays including indirect ELISA and fluorescent microsphere immunoassays for diagnosis of porcine deltacoronavirus[J].Biomed central microbiology veterinary research，2016（12）：95.

[13] JUNG K，HU H，EYERLY B，et al. Pathogenicity of 2 porcine deltacoronavirus strains in gnotobiotic pigs[J]. Emerging infectious diseases，2015，21（4）：650-654.

[14] WANG L，BYRUM B，ZHANG Y. Detection and genetic characterization of deltacoronavirus in pigs，Ohio，USA[J]. Emerging infectious diseases，2014，20（7）：1227-1230.

[15] SINHA A，GAUGER P，ZHANG J，et al. PCR-based retrospective evaluation of diagnostic samples for emergence of porcine deltacoronavirus in US swine[J].Veterinary microbiology，2015（179）：296-298.

[16] 逄凤娇，张柏猛，何孔旺，等. 猪δ冠状病毒M基因RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 畜牧与兽医，2016，48（9）：50-53.

[17] 郑丽，王利丽，路超，等. 猪德尔塔冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学，2017，47（3）：334-340.

[18] 张帆帆，宋德平，周信荣，等. 新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用[J]. 中国农业科学，2016，49（7）：1408-1416.

[19] SONG D，ZHOU X，PENG Q，et al. Newly emergedporcine deltacoronavirus associated with diarrhoea in swine in China：identifcation，prevalence and full-length genome sequence analysis[J]. Transboundary & emerging diseases，2015，62（6）：575-580.

[20] ZHANG J，TSAI Y L，LEE P A，et al. Evaluation of two singleplex reverse transcription-insulated isothermal PCR tests and a duplex real-time RT-PCR test for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and porcine deltacoronavirus[J]. Journal of virological methods，2016（234）：34-42.

[21] 刘玲玲，曹贝贝，张利卫，等. 新发PDCoV和TGEV双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 农业生物技术学报，2016，24（12）：1955-1963.

[22] 韩丽，周雍，李炳晓，等. 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用[J].中国兽医科学，2017，47（5）：557- 562.

[23] 任玉鹏，张斌，汤承，等. 同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J].中国兽医科学，2016，46（6）：756-762.

[24] MARTHALER D，RAYMOND L，JIANG Y，et al.Rapid detection，complete genome sequencing，and phylogenetic analysis of porcine deltacoronavirus[J].Emerging infectious diseases，2014（20）：1347-1350.

[25] 张利卫，曹贝贝，张云飞，等. 猪δ冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 农业生物技术学报，2017，25（6）：969-975.

[26] 肖帅，刘新生，方玉珍，等. 猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].中国兽医科学，2017，47（9）：1080-1086.

Research Progress on the Pathogenic Characteristics and Detection Techniques of the Porcine Deltacoronavirus

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Zhang Ying1，Yang Limei1，Li Feng1

（1. Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600，China；2. Binzhou Bio-carrier Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600，China）

Porcine deltacoronavirus（PDCoV）is a newly discovered porcine enteric coronavirus in recent years，which is capable of causing severe watery diarrhea，vomiting，dehydration and death of newborn piglets. Its spread of the disease has brought serious economic losses to the swine industry. In order to understand the latest progress of this virus，the origin，classification，morphology，genome structure and function，culture and pathogenicity，were analyzed. Then the progress research on detection technology were also summarized，such as isolation and culture，serological detection techniques，and molecular biological detection techniques（including RT-PCR technology and fluorescence quantitative RT-PCR Technology），hoping to provide a reference for better diagnosis and prevention and treatment of PDCoV.

Porcine deltacoronavirus；pathogenic characteristics；detection；RT-PCR

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）

S852.65

B

1005-944X（2018）01-0061-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.018

杜宪）