黑豆种皮抗田间霉菌活性成分的分离纯化与鉴定

邓俊才 ，杨才琼 ，2，吴海军 ，2，杨文钰 ，刘 江 ，2*

（1.农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，成都 611130；2.四川农业大学生态农业研究所，成都 611130）

黑豆种皮抗田间霉菌活性成分的分离纯化与鉴定

邓俊才1，杨才琼1，2，吴海军1，2，杨文钰1，刘 江1，2*

（1.农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，成都 611130；2.四川农业大学生态农业研究所，成都 611130）

【目的】通过分离、纯化和鉴定黑豆种皮中的主要化学成分，对其田间霉菌抑制活性进行系统评价。【方法】以抑菌活性为指导，采用液相萃取、硅胶柱层析等方法，分离纯化黑豆种皮醇提物中的化学成分，结合核磁共振波谱（NMR）数据鉴定抑菌化合物的化学结构；并采用高效液相色谱质谱联用技术（HPLC-MS）对黑豆种皮中花色苷组分进行定量分析。【结果】黑豆种皮抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取层，从中纯化得到主要活性成分表儿茶素，其对黄曲霉菌（Aspergillus flavus）、黑曲霉菌（Aspergillus nige）、串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）和产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum）具有明显的抑制作用。定量分析结果表明，黑豆种皮中富含矢车菊素葡萄糖苷等花色苷类物质，其在提取过程中可转化形成表儿茶素。【结论】表儿茶素作为黑豆种皮中多酚类物质的重要组成成分，具有较强的抑菌活性，是黑豆抗田间霉菌的主要活性物质。

黑豆；田间霉菌；表儿茶素；抑菌活性；花色苷

黑豆为豆科植物大豆（Glycine max(L.)merr）的黑色种子。2015年版中国药典记载：“黑豆性甘、平，归脾肾经，具有益精明目、养血祛风，利水解毒之功效”[1]。《本草纲目》中记载：“黑豆入肾功多，故能治水、消胀、下气、制风热而活血解毒”[2]。目前，关于黑豆的营养保健功能研究较多，其富含蛋白质、不饱和脂肪酸、膳食纤维素、花色苷、异黄酮、植物固醇等多种营养成分[3-4]，具有降低胆固醇、抗炎、抗氧化等多种功效[5]，使其成为典型的药食同源食物。此外，黑豆中的活性蛋白[6]、多糖[7]、花青素等成分[8-9]亦具有良好的抑菌活性。我们的前期研究发现，田间待收获的大豆易受到黄曲霉菌、黑曲霉菌、串珠镰刀菌和产黄青霉菌等田间霉菌的侵染而发生霉变[10]，而黑豆较其他颜色的大豆更能抵御田间霉菌的侵染[11]，但其抑菌活性成分尚不清楚。本研究以高抗田间霉变黑豆种质的种皮为材料，以抑菌活性为指导，通过植物化学方法分离纯化其抑菌活性成分，并鉴定其结构，为开发防治大豆田间霉变的药剂奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 研究仪器

旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、循环水真空泵（河北省予华仪器有限公司）、真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、超净工作台（新加坡易思高科技有限公司）、Bruker AVANCE 600核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司）。Agilent 1260高效液相色谱质谱联用仪系统，包括四元泵（G1311A）、在线真空脱气机（G1322A）、柱温箱（G1316A）、自动进样器（G1313A）、Agilent 6120单四级杆质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）。

1.2 研究材料

正相层析柱硅胶（青岛海洋化工厂分厂）、薄层硅胶层析板（默克化工技术（上海）有限公司）。分析纯甲醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇（四川科龙化工试剂厂）、生物纯二甲基亚砜（DMSO）。8种花色苷标准品：飞燕草素半乳糖苷（DEA）、飞燕草素葡萄糖苷（DEL）、矢车菊素半乳糖苷（CYA）、矢车菊素葡萄糖苷（CYL）、天竺葵素葡萄糖苷（PEL）、矮牵牛色素葡萄糖苷（PET）、芍药色素葡萄糖苷（PEO）、矢车菊素（CYC）均购自 PhytoLab GmbH&Co.KG，Germany。

试验所用黑豆种质为四川省南充市农业科学院提供的黑豆育种中间材料C103，经鉴定，该材料为豆科蝶形花亚科大豆属植物大豆（Glycine max(L.)merr），其籽粒较小，呈椭圆形，表皮黑色，光滑，子叶两瓣，呈淡黄色。种质资源现保存于四川农业大学农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室。该黑豆种质于2015年夏季种植于四川农业大学教学科研园区（四川雅安），采集的黑豆籽粒于室内风干后剥取种皮，粉碎后密封保存于干燥器中备用。

供试霉菌为本实验室从田间霉变的大豆籽粒上分离纯化获得的黄曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.nige）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）和产黄青霉菌（P.chrysogenum），菌种现保存于四川农业大学农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室。

1.3 研究方法

1.3.2 黑豆种皮醇溶物的提取与萃取分层

黑豆种皮活性成分的分离、纯化与鉴定参考张名位等的方法[12]，并做一定修改。取干燥的黑豆种皮粉末，按料液比1∶4加入甲醇于大烧瓶中浸提12 h，倒出滤液，加2倍体积甲醇80℃热回流提取滤渣3 h，趁热过滤，重复3次，合并所有滤液并抽滤，40℃下减压浓缩滤液得总醇提物。超声混悬总醇提物于水中，分别用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇逐步萃取，减压浓缩、干燥得各萃取物。

1.3.2 提取物的抑菌活性评价

采用抑菌圈法对各提取物进行抑菌活性评价[13]。分别称取适量黑豆种皮醇提物及各萃取物，以少量DMSO助溶后用无菌水配成50 mg/mL的溶液备用。将经过活化的4种供试霉菌接种到马丁培养基上，28℃下恒温培养至分生孢子成熟，用无菌水洗脱孢子并配成2×106个/mL的菌悬液。取20 μL菌悬液于灭菌后的培养皿中，加入20 mL冷却至40℃左右的马丁培养基，振荡摇匀，待培养基凝固后，用灭菌的打孔器在每个培养皿中间部位打1个直径为6 mm的小孔，加入种皮提取物溶液，以无菌水作对照，置28℃下恒温培养2 d，测量抑菌圈的大小。每个样品设3次重复，结果计算平均值。

1.3.3 活性部位的进一步分离纯化

根据抑菌活性结果，对活性最佳的乙酸乙酯萃取物作进一步分离纯化。称取适量乙酸乙酯萃取物，以正相硅胶（φ=75 μm）拌样，干法上样。根据薄层色谱法预试结果，选择正己烷-乙酸乙酯溶剂系统（V∶V=3∶1、1∶1、1∶3）、氯仿-甲醇-水溶剂系统（V∶V∶V=3∶1∶0、1∶1∶0、10∶3∶1、7∶3∶1、6∶4∶1）依次梯度洗脱，将所得流分用薄层色谱检测合并相似流分，得到E1～14共14个组分。将各组分用无菌水配成50、10、1、0.1mg/mL的梯度溶液，参照“1.3.2”的方法进行抑菌活性测定，结果表明，E13的抑菌活性最强，故先对其进行成分分析。称取适量E13，甲醇溶解后过0.22 μm的有机相滤头，滤液上高效液相色谱仪进行成分分析。色谱柱：YMC C18柱（250 mm×4.6mm）；流动相：30%甲醇水溶液；流速：0.8 mL/min；进样量：15 μL；检测波长：254 nm。分析结果显示，E13呈现规则的单一色谱峰，表明该部位只含有一种物质，可直接用于结构鉴定。

1.3.4 抑菌单体化合物的结构解析

将E13溶于氘代甲醇并转移至2.5 mm×100 mm的核磁管中，以四甲基硅烷（TMS）为化学位移内标，进行NMR谱分析，分别收集氢谱和碳谱数据。

1.3.5 黑豆种皮花色苷的定量分析

参考Wu H.等[14]的方法对黑豆种皮中的花色苷进行定量分析。准确称取黑豆种皮干燥粉末样品100 mg于10 mL离心管中，加入2 mL甲醇酸性水溶液（VHCl∶VMeOH（80%）=1∶99）冰水浴上避光超声提取3 h，4℃下13000 r/min离心10 min，取1.5 mL上清液过0.22 μm滤膜至2 mL进样瓶中，上LC-MS检测分析。色谱柱：X-Terra MSC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：10%甲酸水溶液（A）-甲醇/乙腈/水/甲酸的混合液（B，V∶V∶V∶V=22.5∶22.5∶40∶10）；梯度洗脱程序：0～8 min，83～80%A，8～10 min，80～65%A，10～20 min，65～52%A，20～25 min，52～83%A；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。质谱干燥气（N2）流速：12 L/min；雾化器压力：45 Psig；干燥气温度：350℃；毛细管电压：3800 V；离子源：电喷雾离子源（ESI）；电离方式：正离子。SIM模式提取目标化合物的色谱峰，目标化合物的质荷比（m/z）为 465（DEA）、465（DEL）、449（CYA）、449（CYL）、479（PET）、433（PEL）、463（PEO）和 287（CYC）。根据 8 种花色苷标准品浓度与色谱峰面积的标准曲线计算样品中各花色苷的含量。试验设置5次重复。

2 结果与分析

2.1 黑豆种皮醇提物的抑菌活性比较

采用抑菌圈法比较了黑豆种皮甲醇粗提物及各萃取物对4种田间霉菌的抑菌效果。由表1可知，黑豆种皮醇提物能够抑制4种霉菌的生长，黑豆种皮醇提物中存在抑制田间霉菌生长的活性物质。比较各萃取物的抑菌活性发现，正己烷萃取物和水萃取物的抑菌活性较差，与对照相比无显著差异；乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物具有较强的抑菌活性，且乙酸乙酯萃取物对4种霉菌的抑制效果均显著优于正丁醇萃取物和甲醇粗提物；这表明黑豆种皮中的抑菌活性物质主要集中在乙酸乙酯萃取部位，而液相萃取对活性物质具有明显的富集作用。

表1 黑豆种皮醇提物及各萃取层对4种田间霉菌的抑菌效果Table1 The antimycotic activities of ethanol extract and each fraction from black soybean seed coat to field mold mm

2.2 抑菌活性成分的结构鉴定

通过对乙酸乙酯萃取物活性部位E13进行成分分析，在30 min检测时间内只出现1个色谱峰，且峰形较好，左右对称，无拖尾现象（见图1）。该结果表明，E13只含有一种化合物。E13干燥样品为白色结晶粉末，溶于甲醇。以CD3OD为溶剂对E13进行1维NMR分析，其1H和13C波谱数据分别为：1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.99（1H，d，J=2.0 Hz，H-2’），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5’），6.77（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6’），5.96（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），5.93（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），4.83（1H，brs，H-2），4.20（1H，m，H-3），2.86（1H，dd，J=17.0，4.5 Hz，H-4），2.74（1H，dd，J=17.0，3.0 Hz，H-4），5.93（1H，d，J=2.0 Hz，H-8）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：157.98（C-5），157.86（C-7），157.36（C-9），145.93（C-3’），145.77（C-4’），132.28（C-1’），119.41（C-6’），115.90（C-2’），115.33（C-5’），100.09（C-10），96.42（C-6），95.90（C-8），79.87（C-2），67.48（C-3），29.24（C-4）。结合相关文献比对[15-16]，上述波谱数据与表儿茶素（（2R，3R）-2-(3，4-Dihydroxyphenyl)chroman-3，5，7-triol，Epicatechin）完全一致，确定该化合物为表儿茶素（见图1）。

图1 E13 HPLC图及表儿茶素化学结构Figure1 The chromatogram of fraction E13 and structure of epicatechin

2.3 表儿茶素的抑菌活性鉴定

表儿茶素对4种供试田间霉菌抑菌效果见表2。从表中可看出，0.1 mg/mL和1 mg/mL的表儿茶素对4种霉菌无明显的抑菌效果，当浓度大于10 mg/mL时开始具有明显的抑菌效果。抑菌能力表现为：黄曲霉菌＞产黄青霉菌＞黑曲霉菌＞串珠镰刀菌，与乙酸乙酯萃取物对4种霉菌的抑菌能力排序一致。

2.4 黑豆种皮花色苷含量分析

LC-MS分析结果表明，从黑豆种皮中检测到了5种花色苷成分 CYL、PEO、CYA、PEL 和 CYC，未检测到DEA、DEL和PET（见图2）。5种花色苷的总含量为62.15 mg/g，其中以CYL的含量最高，占总花色苷含量的97.10%，其次为PEO（2.14%），CYC的含量最低（0.04%）（见表 3）。

表2 表儿茶素对4种田间霉菌的抑菌效果Table2 The antimycotic activities of epicatechin to field mold mm

表3 黑豆种皮中5种花色苷含量Table3 The concentration of five anthocyanins in black soybean seed coat

3 讨论与结论

植物源抑菌活性成分源自天然，易降解，具有低毒、低残留、对人畜相对安全等优点，成为当今研发新型杀菌抑菌剂的热点[17]。植物源活性成分的常规制备方法主要是根据各成分的物理化学特性，采用萃取法、离子交换法和柱层析等方法进行分离纯化[18]。但植物中的组分复杂多样，有效成分含量较低，采用常规方法制备周期长、工序多、盲目性大、分离效率低。本研究在对黑豆种皮抑菌活性成分的分离纯化过程中，以抑菌活性为指导，逐步追踪活性部位，使分离纯化过程更有针对性，减少了盲目分离成分所浪费的人力和物力，提高了活性成分的纯化效率。

图2 花色苷标准品及样品提取离子流图Figure2 Ion chromatograms of anthocyanin standard mixture and seed coat extract

黑豆种皮因含有大量花色苷等黄酮类成分而具有良好的生物活性。张花利等[9]研究表明，黑豆种皮中的黄酮类提取物能够抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。褚盼盼等[8]的研究则进一步指出，黑豆种皮中的花青素对这3种细菌表现出良好的抑菌活性。而关于黑豆种皮对真菌的抑制效果目前还少见报道。本研究结果显示，黑豆种皮甲醇提取物能有效地抑制4种田间霉菌的生长，表明黑豆种皮中存在抑制真菌的活性成分。通过比较各萃取物的抑菌活性，将乙酸乙酯萃取物确定为重点分析部位，通过抑菌活性追踪，最终分离纯化得到抑制田间霉菌的活性成分表儿茶素。

表儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，属于类黄酮化合物中的黄烷-3-醇类，与花色苷、原花青素等共享从苯丙氨酸到花青素这一部分生物合成途径。花青素在花青素还原酶的作用下生成儿茶素和表儿茶素，可进一步聚合成原花青素，而糖基转移酶则竞争性地催化花青素形成花色苷[19]。已有研究表明，黑豆种皮化学成分以多酚类为主，包括原花青素、花色苷及儿茶素三大类。其中，花色苷的主要成分为矢车菊素葡萄糖苷（CYL），占总花色苷的比例高达90%以上[14]，而表儿茶素的含量则相对较低（0.1%～0.4%）[20]。本研究中，我们从黑豆种皮中分离纯化得到大量的表儿茶素，其可能为种皮在提取过程中的高温处理导致原花青素和花色苷降解所致。

本研究对黑豆种皮中抑菌活性成分进行了跟踪纯化，表儿茶素作为主要活性成分被大量纯化获得，一方面，该纯化过程效率较高；另一方面，却忽略了微量活性化合物的富集纯化。为深入探究大豆抗田间霉变机理，筛选高抑菌活性成分，还需对种皮中的其他成分开展更全面的研究。

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Purification and Identification of Anti-Field Moldy Compounds in Black Soybean Seed Coat

DENG Jun-cai1，YANG Cai-qiong1，2，WU Hai-jun1，2，YANG Wen-yu1，LIU Jiang1，2*
（1.Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System in Southwest，Ministry of Agriculture，Chengdu 611130，China；2.Institute of Ecological Agriculture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

【Objective】To investigate the chemical constitutes in black soybean seed coat with antifungal activity to field fungi.【Method】The antifungal constitutes were isolated and purified by stratification and silica gel column chromatography guided by antifungal activities.The structures of antimycotic compounds were elucidated on the basis of various spectroscopic analysis and NMR data comparisons.The antifungal activity were tested by inhibition circle method.【Results】The antimycotic compounds in black soybean seed coat were mainly concentrated in ethyl acetate extraction，from which epicatechin was isolated.The result indicated that epicatechin possessed significantly antifungal activity to Aspergillus flavus，Aspergillus nige，Fusarium moniliforme and Penicillium chrysogenum.The results of quantitative analysis showed black soybean seed coat contained large amount of cyanidin 3-glucoside and other forms of anthocyanins，which could be converted to epicatechin during extraction process.【Conclusion】Epicatechin is one of the basic ingredients constituting polyphenol compounds in black soybean seed coat,and possesses antifungal activity to field fungi.

black soybean；field moldy；epicatechin；antimycotic activity；anthocyanin

R284.1；R284.2

A

1000-2650（2017）04-0499-05

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.006

2017-05-22

国家自然科学基金青年科学基金项目（31401329）；中国博士后科学基金面上项目（2014M560724）资助。

邓俊才，博士研究生。*责任作者：刘江，博士，副教授，从事植物化学生态学研究，E-mail：jiangliu@sicau.edu.cn。

（本文审稿：武 晶；责任编辑：刘诗航；英文编辑：刘诗航）