精神分裂症患者的UHPLC-Q-TOF MS尿液代谢组学研究

郑慧斐 王文强 赖国银 刘发荣 章家新 徐志忠 何珏

精神分裂症患者的UHPLC-Q-TOF MS尿液代谢组学研究

郑慧斐1王文强1赖国银2刘发荣1章家新1徐志忠1何珏1

目的 利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF MS）对精神分裂症患者和健康对照人群的尿液进行代谢组学研究，寻找精神分裂症患者尿液中的差异代谢物，为精神分裂症患者代谢综合征的早期筛查提供科学依据。方法 尿液样品经稀释过滤后进样分析，利用主成分分析方法分析所采集的数据。结果 根据谱库共筛选了7个表征标记物，并进行了结构鉴定。结果发现，精神分裂症患者较对照组尿液代谢表型有显著差异，主成分分析得分散点图中对照组与精神分裂症患者组分类良好。结论 精神分裂症患者糖、脂、氨基酸等代谢通路均发生紊乱，可能在代谢综合征发生发展中有重要作用。

精神分裂症；代谢组学；超高效液相色谱；飞行时间质谱

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS），与心血管病紧密相关，是一种涉及多种代谢异常的疾病，主要表现为患者体重增加（腹型肥胖）、胰岛素抵抗、糖代谢调节异常、高血压和脂代谢异常，MS患者心脑血管疾病的患病风险显著高于普通人群。作为我国重点防治重性精神疾病之一的精神分裂症，其患者合并MS的风险显著高于普通人群，按照美国国家胆固醇教育计划成人治疗组第三次指南（NCEP-ATP III）的标准，精神分裂症患者MS患病率是普通人群的4倍多，合并MS已成为精神分裂症预后不良的重要原因[1-2]。代谢组学是利用对照组和实验组的代谢组（metabolome，某一生物的所有代谢物组分）进行比较，以寻找代谢谱差异的研究方法。超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF MS）是一种先进的分离分析技术，具有高分辨率、高灵敏度，和高精确性等优点，尤其对于非靶标代谢组学分析，是目前公认最好的复杂样品分析技术之一[3]。同时，基于LC-Q-TOF MS采集的数据，可结合统计分析软件MPP进行主成分分析和患者模型的建立。

本研究利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF MS）检测精神分裂症患者（经厦门市仙岳医院副高级以上的精神科医生根据ICD-10精神分裂症诊断标准进行诊断）尿液中代谢物成分的变化，通过主成分分析筛查潜在的生物学标记物，研究精神分裂症患者合并MS的发生发展机制，为MS的早期筛查及早期临床诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6540 UHD高分辨飞行时间质谱仪（美国Agilent公司），配备Mass Hunter Data Acquisition实时采集工作站和鞘流双电喷雾离子源（dual Jet Stream ESI）；Agilent 1290系列超高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配备自动进样装置、在线脱气系统、柱温箱、四元泵；Mass profiler professional；5804 R型高速离心机（德国Eppendorf公司）。乙酸铵（分析纯）；乙腈，甲酸（HPLC级，德国Merk试剂公司）。实验用超纯水使用MILLI-Q系统获得。

1.2 样本来源

精神分裂症患者组尿样30例和健康对照组尿样30例来源于福建省厦门市仙岳医院（采集于2016年11月—2017年5月）。研究通过厦门市仙岳医院伦理委员会批准，所有患者均签署过知情同意书。患者经厦门市仙岳医院副高级以上的精神科医生根据ICD-10精神分裂症诊断标准进行诊断确诊为精神分裂症。患者组和健康对照组人群都在清晨留取中段尿，尿样标本经过尿常规检测，排除了血尿、菌尿和胆红素尿等异常尿样。尿样采集后以3 000 r/min离心10 min，以去除尿液杂质，吸取上清样本存入-80℃冰箱备用。

1.3 样品处理

尿液上清样本用四倍稀释法，从-80℃冰箱取出标本后0℃下溶解，离心（12 000 r/min，4℃，5 min），取100 μl上清液，加超纯水稀释至400 μl，经过涡旋处理，用0.45 μm滤膜过滤样品，所得待测样品供UHPLC-Q-TOF MS分析。为了检验系统的稳定性，避免系统误差，每分析5个实验样本后，用质控样本（quality control）分析一次，QC样本是分别随机从10个精神分裂症患者和10个健康对照的尿液样本中取等量样本混合后所得。

1.4 UHPLC-Q-TOF MS代谢组学分析条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5μm）；流动相A：超纯水（含0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵）；流动相B：乙腈。梯度洗脱：0～5 min，30%B；5～8 min，30%～80%B；8～12 min，80%～85% B；12～15 min，85% ～ 95%B；15～ 20 min，95%B；20～ 21 min，95% ～ 100%B；21～ 22 min，100% ～ 10%B；22～ 25 min，10%B。流速0.4 ml/min；柱温35℃；进样量2 μl。

1.4.2 质谱条件 应用鞘流双电喷雾离子源在正离子扫描方式下采集数据，参比离子m/z为121.050 9和922.009 8，离子扫描范围m/z 100～1 100。毛细管电压3 500 V，碎裂电压110 V，雾化气压力241 kpa，干燥气为高纯N2，干燥气温度300℃，干燥气流速11 L/min，鞘气温度300 ℃，鞘气流速9 L/min。二级质谱参数中碰撞能量设定为10～40 eV。样品测试前，需用调谐液进行质量轴校准。

1.5 数据处理

液相-质谱联用数据由Mass Hunter Acquisition（Agilent公司）采集，采集数据导入Mass Hunter定性分析软件，将结果转化成CEF格式文件，其中包含化合物的保留时间和质荷比信息。将CEF文件导入Mass Profiler Professional （MPP，Agilent Technologies，USA）软件，进行滤噪、归一化后，多变量数据进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），将多维的数据压缩成四维主成分（PCs）来描述数据内部的特征。分析PCA载荷图（Loading plot），发现可作为生物标记物的化合物，予以鉴定。然后根据偏最小二乘判别分析（Partial least square discriminant analysis，PLSDA）法建立相关的预测模型。

2 结果

2.1 质控（QC）样本UHPLC-Q-TOF MS总离子流图

尿液样本进行检测分析时每分析5个实验样本，用QC样本分析一次，通过对所有QC样本UHPLC-Q-TOF MS总离子流图进行叠加，可见QC样本的重现性良好，检测系统稳定。

2.2 精神分裂症患者和正常人尿液UHPLC-Q-TOF MS总离子流图

患者组及对照组尿液样品经UHPLC-Q-TOF MS在正离子模式下进行检测分析。图1中曲线1为精神分裂症患者组尿液混合液（随机选取10个患者尿液标本各吸等量），曲线2为健康对照组尿液混合液（随机选取10个健康对照尿液标本各吸等量）进样的总离子流图（Total ion current，TIC），在正离子模式下，二组色谱峰存在明显的差别，推测两组的尿液代谢成分中存在浓度差异物质（关于图1的详细解读，见www.chsmzz.com）。

图1 尿液混合液UHPLC-Q-TOF MS总离子流图

图2 样本的PCA得分图

2.3 数据分析

2.3.1 特征化合物的筛选 在Mass Hunter 软件的分子特征识别模式下，共提取到653个化合物，通过Filter by Flag排除仅在一个样本中出现的化合物，而不存在于其他样本中，这些化合物没有普遍性，不适用于统计学分析。剩下的328个化合物以出现频率（frequency）为70%，变异系数（coefficient of variation，CV）小于30.0%，丰度（abundance）信号强度值为10 000.0～18 925 010.0进行过滤筛选，共得到167个化合物。

2.3.2 主成分分析（PCA） 以筛选后的167个化合物为基础，采用主成分分析考察精神分裂症患者和健康人群尿液代谢物变化，图2显示样本的PCA得分图，共得到4个主成分，PC1、PC2、PC3、和PC4的贡献率分别为45.06%、7.95%、6.6%和4.73%，累计贡献率为64.34%。PCA图中每一个点表示一个对应样本，经过对图中的精神分裂症患者组尿液样本、健康对照组尿液样本，质控样本进行分析可知，患者组基本聚在一起，与对照组之间的分离明显。每个样本所处位置由自身的代谢决定，相同病理生理状态下的样本通常具有相似代谢物，所以在得分图上也处于相似位置，彼此间距离越远，表明其病理生理状态相差越大（关于图2的详细解读，见www.chsmzz.com）。

2.3.3 偏最小二乘判别分析（PLS-DA） 前面的非监督PCA统计中，可观察到两组有明显分离趋势。使用有监督式方法PLSDA进行建模分析，以进一步寻找差异物质，分析显示精神分裂症患者组和健康对照组的样本可完全区分，所建立的模型稳定，预测率也很高，代表模型预测率Q2＝0.96，具有较好的预测能力。

2.3.4 潜在标志物鉴定 表1是根据精确分子量、串联质谱结果以及与数据库比对，进行的生物标记物鉴定，谱库筛选了7个表征标记物，从而提示精神分裂症患者的糖、脂、氨基酸等代谢通路均发生了紊乱，可能在MS的发生发展中有重要的作用[4]。

3 讨论

尿液中葡萄糖、丙氨酸含量显著异常，提示肾小管对低分子量化合物重吸收的异常，是肾脏损伤的重要标志[5-6]。马尿酸及马尿酸前体物质由肠道菌群代谢产生，肠道环境的改变导致两组马尿酸差异[7]。吡咯啉羧酸（Pyrroline hydroxycarboxylic acid）在羟脯氨酸氧化酶作用下，可氧化生成谷氨酸和吡咯啉烷羟基羧酸[8]。因此，吡咯啉羧酸的异常提示精神分裂症组脯氨酸代谢通路异常。而脯氨酸由谷氨酸合成，是蛋白胶原的主要成分，而胶原作为动脉粥样硬化斑块的主要成分，在冠心病的不稳定性和发展过程中发挥重要作用。二氢神经鞘氨醇是神经酰胺的重要合成前体，而神经酰胺参与血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞凋亡，可能通过内皮细胞损伤影响机体的血压状态[9]。因此，二氢神经鞘氨醇的异常提示精神分裂症组患者的血压异常可能与二氢神经鞘氨醇的磷脂代谢相关，与MS的发病紧密相关。

代谢组学可通过质谱、核磁共振等技术，对代谢物质的代谢途径以及这些物质产生代谢变化的规律采集数据，让数据表达成代谢指纹图谱，再利用化学计量学方法对信息深入提取与挖掘。代谢组学的研究对象为生物体液，例如血液、尿液、唾液、胆汁等。人类代谢组学研究通过检测人体内代谢物成分的变化来显示人体在疾病或药物的作用下代谢网络之变化规律[10]。本文即为应用UPLC-Q-TOF MS技术的代谢组学方法，并结合多元统计分析精神分裂症患者和健康对照组的尿液代谢谱图变化情况的研究。结果表明，精神分裂症患者的尿液代谢谱与正常对照组有显著差异。通过谱库筛选，对可能的代谢差异物进行鉴定，发现了多种标记物。从代谢物组学的角度分析精神分裂症患者合并MS的发生和发展机制，为MS早期筛查及早期临床诊治提供依据。同时，本研究为小样本量的初步研究，后续研究需增加样本例数，评估精神分裂症患者的疾病分期和临床症状，探讨精神分裂症患者代谢差异物与所服用的精神科药物相关性，并且从精神分裂症患者首诊开始跟踪代谢物的差异和变化，以更好地为临床治疗提供支持和依据。

表1 基于UHPLC-Q-TOF MS的尿液代谢差异物

[1]吴文源. 精神分裂症患者代谢综合征的预防[J]. 中华精神科杂志，2014，47（3）：171-172.

[2]Yang CY，Lo SC，Peng YC. Prevalence and predictors of metabolic syndrome in people with schizophrenia in inpatient rehabilitation wards[J]. Biol Res Nurs，2016，18（5）：558-566.

[3]Yue R，Zhao L，Hu Y，et al. Rapid-resolution liquid chromatography TOF-MS for urine metabolomic analysis of collagen-induced arthritis in rats and its applications[J]. J Ethnopharmacol，2013，145（2）：465-475.

[4]谭庆荣. 精神分裂症伴发代谢综合征的处理[J]. 中华精神科杂志，2014，47（3）：172-173.

[5]皮子凤，门丽慧，张静，等. 五味子治疗大鼠糖尿病肾病作用机制的血清代谢组学研究[J]. 分析化学，2015，43（2）：169-175.[6]董飞侠，黄迪，何立群，等. Ⅲ期慢性肾病肾阳虚证患者尿液代谢组学特征的研究[J]. 中华中医药杂志，2008，23（12）：1109-1113.

[7]王娟，李中峰，赵慧辉，等. 冠心病不稳定心绞痛血瘀证患者尿液代谢组学特征的研究[J]. 北京中医药大学学报，2012，35（4）：284-288.

[8]Zimmerli LU，Schiffer E，Zurbig P，et al. Urinary proteomics biomarkers in coronary artery disease[J]. Mol Cell Proteomics，2008，7：290.

[9]张洁，严丽娟，林琳，等. 基于UPLC-oa-TOF-MS的糖尿病及糖尿病肾病的代谢组学研究[J]. 高等学校化学学报，2008，29（11）：2171-2173.

[10]Kim OY，Lee JH，Sweeney G. Metabolomic profiling as a useful tool for diagnosis and treatment of chronic disease：focus on obesity，diabetes and cardiovascular diseases[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther，2013，11（1）：61-68.

Study on Urine Metabonomics of Schizophrenia Patients by UHPLC-Q-TOF MS

ZHENG Huifei1 WANG Wenqiang1 LAI Guoyin2 LIU Farong1 ZHANG Jiaxin1 XU Zhizhong1 HE Jue1 1 Laboratory of Mental Health, Xiamen Xianyue Hospital, Xiamen Fujian 361012, China; 2 Laboratory of Food Chemistry, Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen Fujian 361026, China

Objective An ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometric (UHPLC-Q-TOF MS)method is developed for the study on metabolic variations of urine from schizophrenia patients and healthy volunteers.And the study will provide a scienti fi c basic for early screening of schizophrenia comorbied with metabolic syndrome. Methods The urine samples would analyze after they were diluted and fi ltered, then principal component analysis method was used on the collected data.Results A total of 7 characterization markers were selected and the structural identi fi cation was carried out.PLS-DA was used for group differentiation and potential biomarkers selection. As shown in the scores plot, the distinct clustering among schizophrenia patients and healthy volunteers was observed. Conclusion It is suggested that the metabolic pathways such as carbohydrate,lipid and amino acid in schizophrenia can be disturbed, and show the metabolic disturbance in schizophrenia patients may play an important role in the development of metabolic syndrome.

schizophrenia; metabolome; UPLC; TOF MS

R965

A

1674-9316（2017）27-0155-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2017.27.082

福建省卫生计生委青年科研课题项目（2014-2-77）

1福建省厦门市仙岳医院精神卫生研究室，福建 厦门361012；2厦门出入境检验检疫局技术中心食品理化实验室，福建 厦门 361026

王文强