丽水市中心医院产KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学研究

赵赟安 丁卉 胡晓蕾 黄建胜 赵志钢

丽水市中心医院产KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学研究

赵赟安 丁卉 胡晓蕾 黄建胜 赵志钢

目的 明确丽水市中心医院产KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征，为临床抗感染治疗提供实验依据。方法收集2011年3月至2015年10月丽水市中心医院分离的碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌（CR-KP）。采用Vitek2-compact系统鉴定菌株并联合纸片扩散法（K-B法）检测其药敏，改良Hodge试验检测碳青霉烯酶；PCR法扩增KPC基因，测序后利用BLAST比对确定基因型；肠杆菌科基因间重复序列分型法（ERIC-PCR）联合多位点序列分型（MLST）鉴定菌种同源性；进而探讨产KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征。结果 共收集到70株CR-KP，其中68株改良Hodge试验阳性，扩增产物测序结果均为blaKPC-2基因。ERIC-PCR结果显示，70株KPC型肺炎克雷伯菌分为A、B、C、D、E5个克隆群分别为63株(90.0%)、3株、2株、1株、1株；MLST分成6个ST型，其中ST11型63株（90.0%)，ST35型2株，ST1型2株，ST592、ST1883、ST494型均1株。结论 丽水市中心医院碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的主要克隆群为ST11型，是我院流行感染的主要原因。

碳青霉烯酶 肺炎克雷伯菌 肠杆菌科重复序列 多位点序列分型 分子流行病学

肺炎克雷伯菌是临床常见的条件致病菌之一，近年来随着大量抗生素的广泛使用导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率居高不下，产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌最主要的耐药机制，其中在我国以产KPC酶为主[1]。笔者对我院分离到的耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（CR-KP）扩增KPC基因并测序比对，联合肠杆菌科基因间重复序列分型技术（ERIC-PCR）和多位点序列分型（MLST）对阳性菌株进行分子流行病学分析，分析丽水地区产KPC酶的肺炎克雷菌伯流行特征。

1 材料和方法

1.1 菌株来源 收集2011年3月至2015年10月我院从临床分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，剔除重复菌株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853由卫生部临床检验中心惠赠，KPC阳性肺炎克雷伯菌IR79由浙江大学附属儿童医院细菌室周明明惠赠。

1.2 仪器与试剂 药敏MH培养基和药敏纸片均购自英国Oxoid公司，包括头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、头孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、复方磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、阿米卡星、米诺环素、多黏菌素B、磷霉素。Vitek-2compact细菌鉴定仪购自法国梅里埃公司。

1.3 药物敏感性试验 采用Vitek2-compact全自动微生物分析系统联合纸片扩散法（K-B法）进行药物敏感性试验，药敏结果按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2015 年的标准判定[2]。

1.4 改良Hodge试验 配制大肠埃希菌ATCC259220.5麦氏浊度，1∶10稀释后均匀涂布于M-H平板，平板中央贴厄他培南纸片（10μg）。接种环挑取2～3个待测菌菌落，以纸片边缘为起点离心方向划线接种，35℃培养18～24h后观察结果。大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照菌株，肺炎克雷伯菌IR79为阳性对照株。若抑菌圈内出现“矢”状者为阳性。

1.5 KPC基因检测 PCR引物参考相关文献设计[3]，由上海生物工程有限公司合成。反应体系（50μl）：模板4μl，上下游引物各 2μl，HieffTMPCRMasterMix 混合液25μl，加水至 50μl。反应参数为：94℃预变性 5min，94℃变性 30s，55℃退火 50s，72℃延伸 1min，循环 35 次，最后72℃延伸5min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，120V，30min。PCR阳性产物送上海生物工程公司进行测序，结果与GenBank基因库中递交的序列进行比较（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。

1.6 肠杆菌基因间重复共有序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）分型 热裂解法提取细菌DNA。选用肠杆菌科细菌广泛存在于菌体DNA中的重复序列ERIC1：3′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-5′，ERIC2：3′-AAG －TAAGTGACTGGGGTGAGCG-5′作为引物，参照文献[4]。反应体系（25μl）：模板 2μl，上下游引物各 1μl，HieffTMPCRMasterMix混合液 12.5μl，加水至 25μl。PCR 扩增条件：94℃预变性 1min，94℃变性 1min，42℃退火 1min，68℃延伸2min，35个循环，68℃延伸8min。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中120V电泳30min，凝胶成像系统观察结果并拍照。PCR扩增条带数量及位置相同者为同一克隆群，主要条带位置相同，副条带相差1条的为亚型。否则为不同克隆群[5]。

1.7 多位点序列分型 使用MLST网站提供的肺炎克雷伯菌 7个管家基因（rpoB,gapA,mdh,pgi,phoE,infB,tonB）设计引物，扩增目的序列并测序，测序结果提交到PubMLST网站比对确定ST型。实验引物设计和反应条件参考网址：http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html

1.8 临床资料收集 收集菌株的分离时间、科室、样本类型等资料，查阅患者病历获取临床资料并进行汇总分析。

2 结果

2.1 blaKPC-2基因检测结果 2011年3月至2015年9月共收集到70株KPC型肺炎克雷伯菌，测序后结果提交至NCBI网站比对均为blaKPC-2基因，见图1。

图1 部分KPC基因阳性菌株PCR扩增结果

2.2 产KPC酶肺炎克雷伯菌药物敏感性结果 药敏结果显示CR-KP对大多数β内酰胺类抗生素高度耐药，对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米诺环素耐药率低分别为64.28%、68.57%、28.57%、11.42%，未分离到多黏菌素B耐药的菌株，见表1。

表1 产KPC酶肺炎克雷伯菌对常用抗生素的耐药率（%）

2.3 ERIC-PCR同源性分析 结果提示70株KPC型肺炎克雷伯菌分为 5类克隆群（A、B、C、D、E），A 类为主要克隆群有63株，B、C、D、E为散发的克隆群分别有3、2、1、1株。ERIC分型汇总归纳结果如图2。

图2 ERIC分型结果电泳图（M为DNA标志物，1号代表E类克隆群，2号代表D类克隆群，3、4、5代表B类克隆群，6、7代表C类克隆群，8、9、10、11、12、13 代表 A 类克隆群）

2.4 MLST分型结果 对所有菌株的7个管家基因进行检测，测序比对得到6个ST型，其中以ST11型为主，共有63株占（90.0%），全为ERIC分型中的A克隆群，ST35和 ST1型各 2株，ST592、ST1883和 ST494型各1株，归纳结果见表2。

表2 产KPC酶的肺炎克雷伯菌MLST分型归纳结果（株）

2.5 耐药菌临床分布流行特征 70株产KPC酶的肺炎克雷伯菌中，痰液53株（76.0%），尿液10株（14.0%），其余标本7株（10.0%）。在2011年和2015年我院分离到较多的耐药菌株分别为26株和22株，其中ICU分别为15株和14株曾爆发小规模流行，见表3。全院12个科室都曾分离到耐药菌，70株致病菌中39株分离自ICU 病房（56.0%），15株来自脑外科（21.0%），ICU 和脑外科病房为我院感染流行的主要病区，见表4。

表3 2011和2015年ICU和全院菌株数据（株）

表4 临床各科室菌株分离情况（株）

3 讨论

肺炎克雷伯菌是医院内常见的条件致病菌，可引起呼吸系统、泌尿系统、消化系统及血液系统等感染。近年来由于抗生素的大量使用，使肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药率逐年增加，有报道指出2006年国内肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药率只有不到1.0%[6]，到2012年就高达10.8%[7]。目前，碳青霉烯酶包括Ambler分类中的A类、B类和D类[8-9]。KPC酶是一种容易在肺炎克雷伯菌中流行的A类碳青霉烯酶，其活性部位为丝氨酸残基，主要水解头孢菌素、青霉素类等抗生素。由于KPC基因位于质粒上，可通过转座子、插入序列等结构在不同菌株间传播，容易造成流行感染，应当高度重视。

本研究中70例产KPC酶的肺炎克雷伯菌基因型均为KPC-2型，与国内陆续报道的文章相符[10-13]。实验药敏结果显示CR-KP对大多数β内酰胺类抗生素高度耐药，对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米诺环素耐药率较低分别为64.2%、68.5%、28.5%、11.4%，未分离到多黏菌素B耐药的菌株。本研究联合ERIC分型技术和MLST分型技术对70株耐药菌进行综合分析发现:ST11型产KPC酶肺炎克雷伯菌为主要流行菌株有63株（90.0%），与杭州、宁波、绍兴等地区曾报道的结果一致[14-15]，同时发现所有的ST11型CR-KP均来自同一菌群（ERIC分型中主要克隆群A）。两种方法得到基本一致的实验结果充分证明ST11型CR-KP为丽水地区主要耐药菌群。虽然我院耐药菌基本来源于同一克隆群（ST11型），但仍需警惕其他克隆群菌株的流行。本研究还发现 5 种散发 ST 型：ST1、ST35、ST592、ST494、ST883，其中ST35型2株分离自ICU病区同一床位的前后2例患者，ST1型2株则来自呼吸内科相邻2个床位的患者。这种现象说明耐药菌很可能通过床头柜、椅子、消毒不彻底的棉被等在病区传播，造成交差感染。

在汇总临床资料分析发现，我院的ICU和脑外科为院内感染的主要感染病区，70株致病菌中39株分离自ICU病房占56.0%，15株来自脑外科占21.0%，2011年分离得到的26株耐药菌株，ICU15株（58.0%）；2015年分离到22耐药株，ICU14株（64.0%）。2011年产KPC酶肺炎克雷伯菌首次在ICU爆发小规模流行（2011年7至8月内分离得到10株菌株均为ST11型），之后3年检出率明显下降，但在2015年6至8月ICU又爆发小规模感染（3个月的时间分离得到11株菌株为ST11型）。分析发现ICU容易爆发流行感染很可能与入住ICU的患者常同时具备多种危险因素，长期住院、患者机体功能差、侵袭性操作、免疫抑制状态及前期使用抗生素等紧密相关[16-17]。同时ICU病房患者的转诊治疗很可能为耐药菌院内传播的重要途径。

为了减少院内感染发生，我们不仅加强宣传医院感染的相关知识，增强医护人员和患者家属防护意识，做到早期监测、控制和隔离，而且加强各个科室之间的交流合作，防止因为转科治疗而发生交叉感染。严格要求各个科室增加诊疗环境及物品消毒频次，做到深度消毒，并取得了良好的成果。

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Genotyping of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital

ZHAO Yun’an,DING Hui,HU Xiaolei,et al.
Clinical Laboratory，Lishui Central Hospital,Lishui 323000, China

Objective To identify the genotypes of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital. Methods Seventy clinical strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CR-KP)were isolated from Lishui Central Hospital from March 2011 to October 2015.The strains were identified with Vitek2-compact system,and drug sensitivity was detected with disk diffusion method(K-B method).The modified Hodge test was used to detect carbapenemase;KPC gene was amplified with PCR,and BLAST was used to determine the genotype after the sequencing.Enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence classification (ERIC-PCR)and multiple loci sequence classification (MLST)were used to identify the homology of strains. Results Among 70 strains of CR-KP,68 strains were modified Hodge test positive and confirmed to carry blaKPC-2 gene.ERIC-PCR showed that there were 63 strains of group A(90.0%),3 of group B,2 of group C,1 of group D and 1 of group E.MLST showed that there were 63 strains of ST11(90.0%),2 of ST35,2 of ST1,1 of ST592,1 of ST1883 and 1 of ST494,respectively. Conclusion ST11 is the main genotype of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital.

Carbapenemase Klebsiellapneumoniae Enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence Multipleloci sequence Molecular epidemiology

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-962

浙江省丽水市公益性技术应用研究项目（2014GYX023）

323000 丽水市中心医院检验科

赵志钢，E-mail:zjlszzg@163.com

2017-04-26）

严玮雯）