CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗儿童急性淋巴细胞白血病的效果观察

黄欣 高清平

CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗儿童急性淋巴细胞白血病的效果观察

黄欣 高清平

目的 探讨CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的效果。方法 回顾性选取ALL患儿134例，其中67例（观察组）给予CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗，另67例（对照组）给予常规多药联合化疗。观察并比较两组患儿疗效、化疗不良发应发生率、化疗后热休克蛋白90（Hsp90）表达水平、5年生存率。结果 观察组患儿治疗有效率高于对照组（P＜0.05），化疗不良反应发生率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），化疗后Hsp90 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组（均P＜0.05），5年生存率高于对照组（P＜0.05）。结论 CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗儿童ALL，效果确切，预后相对较佳，值得临床应用。

CCLG-ALL2008 儿童急性淋巴细胞白血病 Hsp90 预后

急性白血病是血液系统的一类恶性肿瘤，严重危害人类健康[1]。儿童是急性白血病的高发群体，其中3/4为急性淋巴细胞白血病（ALL）。ALL的发病率和病死率均较高，在儿童病死原因中居第2位[2]。目前临床对ALL的主要治疗方法是化疗，但ALL发病原因多样、病情复杂多变，治疗相对困难，预后欠佳易复发[3]。且化疗亦严重损害人体正常组织，引发各种不良反应，加上耐药性的出现，化疗效果大打折扣[4]。如何提高化疗效果、减少不良反应是目前临床研究的热点和重点。热休克蛋白90（Hsp90）是一类分子伴侣蛋白，在肿瘤细胞中具有调节多种癌蛋白的功能，参与肿瘤细胞的生存、增殖、转移及侵袭等病理过程；有效抑制白血病细胞内Hsp90的活性，可使白血病细胞发生凋亡和分化，缓解病情[5]。CCLG-ALL2008方案是中国儿童白血病协助组（CCLG）制定的一种化疗方案。有研究显示，CCLGALL2008诱导缓解方案化疗ALL可在最短时间内杀死白血病细胞，获得有效缓解[6]。基于此，本研究旨在观察CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗儿童ALL的效果，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 回顾性选取2010年4月至2012年3月本院收治的经骨髓穿刺术检查确诊为ALL的患儿134例（排除既往接受过化疗者），其中67例（观察组）给予CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗，另67例（对照组）给予常规多药联合化疗。两组患儿性别、年龄、BMI、WBC比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1.2化疗方法

1.2.1 观察组 给予CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗。（1）第 1～7天：给予泼尼松片（Pred）（生产厂家：天津力生制药股份有限公司，批准文号：国药准字H12020123），用量：60mg/（m2·d）；（2）第8～：停止给予Pred改为给予地塞米松（Dex），第29天开始减量，3d减半，9d减停；第8天和第15天给予柔红霉素（DNR）（生产厂家：Actavis Italy S.p.A.，批准文号：H20100552）共 2 次，每次用量：30mg/m2；第 8、15、22、29 天给予门冬酰胺酶（L-ASP）（生产厂家：贵州千红生化制药股份有限公司，批准文号：国药准字H120023613），1次/3d，每次 5 000U/m2；第 8、11、14、17、20、23、26、29 天给予长春新碱（VCR）（生产厂家：浙江海正药业股份有限公司，批准文号：国药准字H120043326）共8次，每次用量：1.5mg/m2；（3）第 1、15、33 天给予氨甲喋呤（MTX）治疗，剂量为：1～5g/m2，治疗期间进行肾功能密切监测，血清肌酐值（Scr）＜1.2mg/dl，则常规给药剂量：5g/m2；Scr在 1.2～2mg/dl，则剂量减半；若＞2mg/dl，则给予 1g/m2。

1.2.2 对照组 给予常规多药联合化疗。（1）第1～7天：给予Pred，用量：60mg/（m2·d）；（2）第8～天：继续给予Pred，第29天开始减量，7d后减停；第8天和第9天加用DNR共2次，每次用量：30mg/m2；给予L-ASP，1次/3d，每次 5 000U/m2；第 8、15、22、29 天给予 VCR，每次用量：1.5mg/m2。

1.3 Hsp90表达水平检测 留取患儿化疗后骨髓液4ml，加入4ml淋巴细胞分离液，2 000rpm离心20min，提取单个核细胞，-80℃冰箱备存。

1.3.1 RT-PCR法检测Hsp90 mRNA表达水平 （1）严格按照Trizol试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司）说明书提取组织总RNA；（2）引物设计：实验引物均由上海博亚生物技术有限公司设计合成；Hsp90引物序列为正义链 5′-GAGAGCCTGACAGACCC-3′，反义链 5′-GCCCAATCATGGAGATGT-3′；β-actin 正义链 5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反义链 5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；（3）采用 Access RTPCR系统（美国Promega公司）将组织总RNA扩增成DNA目的片段，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 30s，30 个循环，72℃终延伸10min；（4）PCR产物经EB染色和1.8%琼脂糖凝胶电泳后，采用紫外分析仪观察，并采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行定量分析，用Hsp90 mRNA与β-actin的灰度比值表示Hsp90 mRNA的相对表达水平。

1.3.2 Western blot法检测Hsp90蛋白表达水平 （1）采用改良异硫氰酸胍法提取总蛋白，-80℃下冻存；（2）蛋白浓度采用NanoDrop分光光度计测量，将蛋白溶入等体积的缓冲液中煮沸10min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离；（3）将蛋白质转印到PVDF膜上；（4）PVDF膜置入封闭液中，4℃下振荡60min，加入一抗（1∶100稀释），4℃过夜，漂洗3次（每次 10min），加入二抗（1∶1 000稀释），37℃孵育 120min，漂洗 3次（每次10min）后，与X线胶片共同放入暗盒内曝光3min，常规显影与定影，将Hsp90与β-actin蛋白的灰度值比值作为Hsp90蛋白相对表达水平。

1.4 观察指标 观察并比较两组患儿疗效、化疗不良发应发生率、化疗后Hsp90表达水平、5年生存率。

1.4.1 患儿疗效 判断标准：（1）完全缓解：临床症状消失；血象：Hb≥100g/L、PLT≤100×109/L、中性粒细胞绝对值≥1.5×109/L，原始粒细胞≤5%，外周血分类无白血病细胞，WBC及巨核细胞正常；（2）部分缓解：5%＜骨髓原粒细胞≤20%，临床症状和血象中任1项未完全达标；（3）未缓解：临床症状、髓象及血象均未达到完全缓解和部分缓解。完全缓解或部分缓解视为治疗有效。

1.4.2化疗不良反应 包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻、PLT减少及感染发生。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法估计两组患者的生存率并绘制生存曲线，两组患者生存率的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿疗效及化疗不良反应发生率比较 观察组患儿化疗后完全缓解56例，部分缓解8例，未缓解3例，发生化疗不良反应11例。对照组患儿化疗后完全缓解39例，部分缓解9例，未缓解19例，发生化疗不良反应12例。观察组治疗有效率高于对照组（95.52%vs 71.64%，P＜0.05），化疗不良反应发生率与对照组比较差异无统计学意义（16.42%vs 17.91%，P＞0.05）。

2.2 两组患儿化疗后Hsp90表达水平比较 见图1-2、表 2。

图1 两组患儿化疗后Hsp90 mRNA的凝胶电泳结果（M：DNA marker）

图2 两组患儿化疗后Hsp90蛋白的凝胶电泳结果

表2 两组患儿化疗后Hsp90表达水平比较

由图1-2、表2可见，观察组患儿化疗后Hsp90 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组（均P＜0.05）。

2.3 两组患儿5年生存率比较 见图3。

图3 两组患儿生存曲线比较

由图3可见，观察组患儿5年生存率高于对照组（22.39%vs 17.91%，P＜0.05）。

3 讨论

白血病属于造血干细胞恶性克隆性的疾病，通常是因造血干/祖细胞发生恶变后，引起细胞增殖、分化及凋亡的异常，从而导致大量白血病细胞增加，正常造血途径受抑制[7]。白血病因基因突变的诱发而产生，通常是多个基因相互作用的结果，其突变主要表现为基因（造血细胞发育与分化基因、凋亡基因、细胞周期基因等）片段丢失或增加、点突变（ras基因）、基因融合及染色体（免疫球蛋白重链、T淋巴细胞抗原受体基因、酪氨酸激酶染色体等）易位等。这种突变是多途径的复杂过程，最终导致原癌基因被激活，而抑癌基因灭活，从而使细胞正常增殖、凋亡被干扰，相互之间平衡被破坏，白血病细胞过度聚集及分化，对正常血液细胞生成产生影响，并会侵袭其他脏器组织[8-9]。

ALL的治疗方法较多，包括生物治疗、放疗、多药联合化疗及造血干细胞移植等，目前多药联合化疗仍是主要的治疗方法[10]。诱导缓解化疗在整个ALL治疗过程中具有重要意义，CCLG-ALL2008诱导缓解化疗方案是多药联合化疗，主要包括激素、VCR、DNR及L-ASP等，可在较短时间内杀死白血病细胞，取得缓解效果[11]。本研究结果显示，观察组治疗有效率高于对照组，两组化疗不良反应发生率无统计学差异。分析原因可能是CCLG-ALL2008诱导缓解化疗方案未全程使用Pred，而是在Pred试验结束后改用Dex，且鞘内注射未选用3药联合而仅3次MTX单药鞘内注射。Dex的半衰期较长，化疗不良反应较小，尤其在ALL初治时，患者体内肿瘤负荷较高，化疗对肿瘤细胞进行破坏溶解时的不良反应会被放大，患者不耐受会影响化疗效果，并使化疗风险增高，甚至引发因化疗死亡事件的发生。在诱导缓解化疗时需平衡利弊，采取合适的化疗方案，CCLGALL2008诱导缓解化疗方案在不增加化疗不良反应的同时提高疗效[12]。另外，ALL化疗时常出现多药耐药现象，白血病细胞对某一种化疗药物产生耐药后，会继而对其他多种药物产生交叉耐药，从而使化疗失败[13]。而CCLG-ALL2008诱导缓解方案在第8天时采取Dex替代Pred，由于Dex的半衰期较长，观察组高剂量Dex的使用可大大降低耐药现象的出现，因此化疗效果更显著[14]。CCLG-ALL2008诱导缓解方案不仅减少鞘内注射的次数，更将3联药物减至单药注射，从而大大降低各种不良反应的发生，减少对器官的损伤及感染的发生。

Hsp90是Hsp家族中的成员之一，最初在升高温度的细胞中被发现，是所有真核及原核细胞生存所必需的分子伴侣，后来被证实在多种细胞中广泛存在[15]。Hsp90在信号蛋白的构象成熟及稳定和参与细胞生长中起重要作用，Hsp90含量可占正常细胞总蛋白的1%～2%，对机体具有保护作用，而在肿瘤细胞中其含量可翻倍表达，对肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭、转移通过调节癌蛋白而参与其过程[16]。本研究结果显示，观察组患儿化疗后Hsp90 mRNA和蛋白表达水平均低于对照组。这是因为Hsp90在细胞质中无处不在，且会与多种蛋白结合形成多伴侣复合物，参与白血病细胞增殖及存活的信号传导途径，并参与白血病细胞的耐药过程[17]。而CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗通过Pred与Dex的适时的替代治疗，可对Hsp90进行有效抑制，阻断Hsp90对白血病细胞蛋白的释放，改变其对恶性肿瘤细胞生存和生长的潜能作用，因此Hsp90表达越低，说明缓解效果越好。

本研究结果显示，观察组患儿5年生存率明显高于对照组。分析原因可能是通过CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗可使患儿更加完全顺利的渡过第一阶段的治疗，缩短骨髓抑制时间的同时降低感染，可提高患儿的治疗依从性并降低复发率，利于预后。

综上所述，CCLG-ALL2008诱导缓解方案化疗儿童ALL，效果确切，化疗不良反应发生率较低，预后相对较佳，值得临床应用。

[1] Traversa G,Menniti-Ippolito F,Da C R,et al.Drug use and acute leukemia[J].Pharmacoepidemiology&Drug Safety,2015,7(2):113-123.

[2] Singh N,Frey N V,Grupp S A,et al.CAR T Cell Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia and Potential for Chronic Lymphocytic Leukemia[J].Current Treatment Options in Oncology,2016,17(6):28.

[3] Douer D.Efficacy and Safety of Vincristine Sulfate Liposome Injection in the Treatment of Adult Acute Lymphocytic Leukemia[J].Oncologist,2016,21(7):840.

[4] Hauner K,Maisch P,Retz M.Side effects of chemotherapy[J].Der Urologe,2015,73(6):39-44.

[5] Georgakis G V,Younes A.Heat-shock protein 90 inhibitors in cancer therapy:17AAG and beyond[J].Future Oncology,2015,1(2):273-281.

[6] 陈晓娟,邹尧,杨文钰,等.CCLG-ALL2008方案治疗儿童急性淋巴细胞白血病复发患儿的特征分析[J].中国当代儿科杂志,2015,17(4):321-326.

[7] Bleakley M,Heimfeld S,Loeb K R,et al.Outcomes of acute leukemia patients transplanted with naive T cell-depleted stem cellgrafts[J].Journalof ClinicalInvestigation,2015,125(7):2677-2689.

[8] Zhou J,Ching Y Q,Chng W J.Aberrant nuclear factor-kappa B activity in acute myeloid leukemia:from molecular pathogenesis to therapeutic target[J].Oncotarget,2015,6(8):5490-5500.

[9] Prunier C,Zhang M Z,Kumar S,et al.Disruption of the PHRF1 TumorSuppressorNetworkbyPML-RARα DrivesAcute Promyelocytic Leukemia Pathogenesis[J].Cell Reports,2015,10(6):883-890.

[10] Yilmaz M,Richard S,Jabbour E.The clinical potential of inotuzumabozogamicin in relapsed and refractory acute lymphocytic leukemia[J].Therapeutic Advances in Hematology,2015,6(5):253-261.

[11] Chen B,Xian Y,Su Y C,et al.A clinical study of drug-related toxicities of CCLG-ALL 08 protocol for childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Chinese Journal of Contemporary Pediatrics,2013,15(9):737.

[12] Wang F,Xiao S J,Lin M.Treatment outcome of childhood standard-risk acute lymphoblastic leukemia with CCLG-08 protocol[J].Chinese JournalofPracticalPediatrics,2013,28(2):111-113.

[13] Rose-James A,Shiji R,Kusumakumary P,et al.Profiling gene mutations,translocations,and multidrug resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia:a step forward to personalizing medicine[J].MedicalOncology,2016,33(9):98.

[14] 王慧敏,欧阳涓,滕军旗,等.地塞米松诱导急性T淋巴细胞白血病细胞耐药及对miR-15b表达的影响[J].热带医学杂志,2016,16(6):695-698.

[15] Lamoth F,Juvvadi P R,Steinbach W J.Heat shock protein 90(Hsp90):A novel antifungal target against Aspergillusfumigatus.[J].CriticalReviews in Microbiology,2016,42(2):310-321.

[16] Liu H,Lu J,Hua Y,et al.Targeting heat-shock protein 90 with ganetespib for molecularly targeted therapy of gastric cancer[J].CellDeath&Disease,2015,6(1):e1595.

[17] Wang R,Shao F,Liu Z,et al.The Hsp90 inhibitor SNX-2112,induces apoptosis in multidrug resistant K562/ADR cells through suppression of Akt/NF-κB and disruption of mitochondria-dependent pathways[J].Chemico-biological interactions,2013,205(1):1.

Efficacy of CCLG-ALL2008 inducing remission chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia

HUANG Xin,GAO Qingping.
Department of Hematology,People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective To evaluate the efficacy of CCLG-ALL2008 induction chemotherapy in children with acute lymphoblastic leukemia(ALL). Methods One hundred and thirty four children with ALL were treated with chemotherapy,including 67 cases receiving CCLG-ALL2008 induced remission chemotherapy (study group)and 67 cases receiving conventional multi-drug combination chemotherapy (control group).The curative effect,incidence of adverse reactions,expression of heat shock protein 90 (Hsp90)after chemotherapy and the 5-year survival rate were observed and compared between the two groups. Results The effective rate in study group was higher than that in control group(P＜0.05).There was no significant difference in incidence of adverse reactions between two groups(P＞0.05).After chemotherapy,the expression of Hsp90 mRNA and protein in study group was lower,and the 5-year survival rate was higher than those in control group(P＜0.05).Conclusion CCLG-ALL2008 inducing remission chemotherapy is more effective than conventional chemotherapy in children with ALL.

CCLG-ALL2008 Childhood acute lymphoblastic leukemia Hsp90 Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-1178

430060 湖北，武汉大学人民医院血液科

高清平，E-mail：gaoqingping@163.com

2017-05-22）

李媚）