5种蟹类线粒体Cyt b基因序列分析及其系统发育

王娜泠，胡则辉，卞光明，柴学军

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；2.江苏省射阳县长荡镇农业技术推广服务中心，江苏盐城 224322）

5种蟹类线粒体Cyt b基因序列分析及其系统发育

王娜泠1，胡则辉1，卞光明2，柴学军1

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；2.江苏省射阳县长荡镇农业技术推广服务中心，江苏盐城 224322）

为研究浙江沿海蟹类系统发育情况，对5种常见蟹类（n=28）的线粒体细胞色素b基因进行扩增，获得650 bp序列片段，其中8个红星梭子蟹样品中检测出4个单倍型，锐齿蟳、锈斑蟳和日本蟳样品中分别检测出2个单倍型，绵蟹中检测出1个单倍型；碱基T、C、A、G和A+T的平均含量分别为37.3%、19.8%、26.5%、15.8%和63.8%，A+T平均含量（63.8%）明显高于G+C（36.2%），符合后生动物线粒体基因碱基偏倚特性；5种蟹类种内遗传距离处于0.000～0.050，种间遗传距离为0.194～0.366，锐齿蟳与绵蟹种间遗传距离最高（0.366），锈斑蟳与日本蟳遗传距离最低（0.194）。通过邻接法构建分子系统树发现蟳属物种首先聚类，然后与同属于梭子蟹科的梭子蟹属物种聚类，最后与绵蟹科绵蟹物种聚类，与相应蟹类形态学分类结果一致。

蟹类；线粒体DNA；细胞色素b；系统发育

浙江沿海的蟹类资源丰富，物种多样性水平高，随着因过度捕捞引起的浙江海域传统底层鱼类资源的衰退，捕食蟹类的底层鱼类减少，浙江沿海蟹类生存空间扩大，资源发生量增多[1]，故而对浙江近海蟹类分子系统发生学和分类学进行相关研究，对于其资源的合理利用具有重要意义。细胞色素b（Cytochrome b，Cyt b）基因是目前研究系统进化的重要目的基因，其进化速率适中、序列保守、遗传信息丰富，既能反映物种亲缘关系，也能为系统发育重建提供重要参数[2]，其结构和功能研究最为清楚，是线粒体DNA蛋白质编码基因中最为可信的分子标记之一，适用于种间、属间系统发育分析[3]。红星梭子蟹Portunus sanguinolentus、日本蟳Charybdis japonica、锈斑蟳C.feriatus、锐齿蟳C.acuta等都是浙江近海海域经济蟹类，绵蟹Dromia dehaani为常见种，蟹类肉质鲜美、营养丰富深受人们喜爱。随着人们对大型经济蟹类的需求量日益增加，蟹类资源的开发和合理利用显得尤为重要。

目前，蟹类Cyt b基因研究主要集中于三疣梭子蟹Portunus trituberculatus[4]、中华绒螯蟹群体遗传特性[5]、亚种比较[6]、RFLP分析[7]、胚胎标记[8]等单个蟹种序列分析及系统发育研究，而多种蟹类Cyt b基因系统发育研究未见报道。本研究对5种蟹类的线粒体Cyt b基因进行扩增、序列分析及构建分子系统发育树，以期获得浙江沿岸蟹类分子系统学基础数据，为浙江沿海蟹类资源的开发与保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用样品取自浙江近海，运回实验室后置于95%的酒精中固定，超低温（-70℃）保存备用，具体采集信息见表1。

表1 采样情况表Tab.1 Information of sampling used in this study

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测

取约30 mg的蟹类螯足肌肉，剪碎组织并根据天根海洋动物基因组提取试剂盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit）操作说明提取样品总基因组DNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，用紫外分光光度计检测DNA质量与浓度，并稀释为50 ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 PCR扩增和测序

从GenBank中下载日本蟳、锈斑蟳、红星梭子蟹的线粒体Cyt b基因序列，比对后通过Oligo7软件[9]设计 PCR 扩增引物：Cyt b-F：5’-CATTTTCTAGAGTAGCGCATATTTGCCGAGA-3’；Cyt b-R：5’-GCAACTGATGCTACTAGTGCAATAACACC-3’（上海生工合成）。PCR 总反应体系（25 μL）：12.5 μL2×Taq MasterMix（康维世纪）、1 μL上下游引物（10 μmol/L）、100 ng模板DNA，ddH2O 补足至25 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性2 min；94℃变性45 s、55℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生工生物技术有限公司测序。

1.2.3 序列分析

通过ContigExpress软件进行拼接，然后使用BioEdit软件[10]对所有序列编辑并辅以人工校正。用MEGA 5.0软件[11]分析序列的碱基组成，并使用Kimura双参模型（K2P）计算各蟹类间的遗传距离。利用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建分子发育进化树，并采用序列数据集1 000次重复抽样检验的自引导值（Bootstrap Value）表示系统树各节点置信度。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

PCR扩增产物凝胶电泳图谱如图1所示，Marker为2 000 bp，从上至下依次为（2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp），产物片段长度处于500～750 bp，与设计的目的片段长度一致，条带清晰明亮、无杂带，满足测序要求。

图1 5种蟹类部分PCR产物电泳图谱Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR products in five species of crabs

2.2 序列分析

本试验共测定了5种蟹类的Cyt b基因，采用ContigExpress软件对正反向序列进行拼接，并通过BioEdit编辑，去除两端不稳定部分，经Genbank中BLAST同源性比对，确认得到650 bp的Cyt b基因片段。8个红星梭子蟹样品中检测出 4 个单倍型（PS1～4），锐齿蟳、锈斑蟳和日本蟳样品中分别检测出 2 个单倍型（CA1～2，CF1～2，CJ1～2），绵蟹检测出1个单倍型（DD1）。

通过MEGA 5.0软件计算5种蟹类Cyt b序列的碱基组成（表2），T、C、A、G的平均含量分别为37.3%、19.8%、26.5%和15.8%，A+T的平均含量为63.8%。5种蟹类Cyt b基因A+T含量处于61.1%～66.4%，平均含量63.8%明显高于G+C（36.2%），符合后生动物线粒体基因AT偏倚性[12]。

表2 5种蟹类线粒体Cyt b基因碱基组成Tab.2 Nucleotide composition of mitochondrial Cyt b genes of five species of crabs

2.3 系统发育分析

对所获得的5种蟹类Cyt b基因片段进行遗传距离分析，由表3可知，5种蟹类种内变异较小，遗传距离范围为0.000～0.050，种间遗传距离处于0.194～0.366，其中锐齿蟳与绵蟹种间遗传距离最高（0.366），锈斑蟳与日本蟳遗传距离最低（0.194）。

表3 5种蟹类种内和种间遗传距离Tab.3 Within and between group meanaverage distance of five species of crabs

利用邻接法构建五种蟹类分子进化树（图2），自检次数为1 000次重复抽样检验各分支置信度，如系统进化树所示，梭子蟹科螃蟹首先聚类，再与绵蟹属螃蟹聚类，不存在不同物种交叉聚类，锐齿蟳、日本蟳首先聚为一支，然后与锈斑蟳聚为一支，再与红星梭子蟹聚为一支，绵蟹独立为一支。

图2 基于Cyt b基因序列构建的NJ系统进化树Fig.2 NJ phylogenetic tree based on Cyt b gene sequences

3 讨论

本研究所获得的蟹类Cyt b序列与Genbank中相应物种Cyt b基因片段BLAST比较，同源性处于93%～99%，排除所得Cyt b基因片段是假基因片段的可能性。Cyt b基因片段中，A+T含量（63.8%）明显高于G+C含量（36.2%），且G碱基含量最低，平均仅为15.8%，这种类型的碱基含量与青蟹Scylla serrata[13-14]、日本绒螯蟹Eriachier japonica[15]、中华虎头蟹Orithyia sinica[16]、相手蟹Sesarma sp.[17]、方蟹科[18]等蟹类线粒体基因片段结构相似。

基于蟹类16S rRNA基因序列研究表明，蟹类种内遗传距离一般小于0.010[19-20]，最大不超过0.015[21]，而本研究中蟹类种内遗传距离处于0.000～0.050，这多是海洋动物线粒体DNA不同区域核苷酸的突变速率或不同基因片段的选择压力不同[22]，Cyt b基因进化速率快于16S rRNA基因。此外，细胞色素b基因在5种蟹类种内也有很高的多样性，8个红星梭子蟹样品中检测出4个单倍型，锐齿蟳、锈斑蟳和日本蟳样品中分别检测出2个单倍型，4种蟹类都有两个或两个以上单倍型，表明细胞色素b基因也可用于群体遗传多样性的分析研究。HEBERT,et al[23]基于COI基因序列的研究表明，大部分物种种间遗传距离不小于0.02，物种遗传分化标准序列阈值为10倍，本实验研究5种蟹类种间遗传距离为0.194～0.366，种间平均遗传距离为0.263，是种内平均遗传距离的19倍，故而，Cyt b标记是区分5种蟹类种间差异的有效分子标记。Cyt b序列NJ系统进化树显示：各分支置信度较高，同一物种首先聚类，不存在不同物种交叉聚类现象，表明Cyt b序列对本研究中的5种蟹类区分度较高。此外，同属于蟳属的锐齿蟳、锈斑蟳、日本蟳首先聚类，然后与同属于梭子蟹科的梭子蟹属的红星梭子蟹聚为一支，最后梭子蟹科的蟹类与绵蟹科的绵蟹聚类，与形态学分类结果一致。

本研究根据Genbank中的日本蟳、锈斑蟳、红星梭子蟹线粒体Cyt b基因片段设计引物，对五种蟹类Cyt b基因片段进行扩增，成功确认得到650 bp的基因片段，表明本研究设计的引物能够适用于多种蟹类Cyt b基因扩增分析。此外，Genbank中未发现锐齿蟳线粒体Cyt b基因序列、其他蟹类Cyt b基因序列较少，研究结果为相关蟹类的分子系统学研究提供基础数据。

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Molecular Phylogeny and Sequence Analysis of Mitochondrial Cyt b Gene in Five Species of Crabs

WANG Na-ling1,HU Ze-hui1,BIAN Guang-ming2,et al
(1.Marine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Changdang Township Agricultural Technology Extension and Service Center of Sheyang Country,Yancheng 224322,China)

In order to study the phylogenetic development of crabs in Zhejiang coastal areas,mitochondrial cytochrome b genes were amplified in five species of crabs(n=28),finally 650 bp sequence fragments were obtained.Four haplotypes were detected from eight Portunus sanguinolentus samples,and two haplotypes were respectivelydetected from Chrybdis acuta,C.feriatus and C.japonica,and one haplotype was detected from Dromia dehaani.The composition of T,C,A,G and A+T were 37.3%、19.8%、26.5%、15.8%and 63.8%,and the composition of A+T(63.8%)was significantly higher than that of G+C(36.2%),which consistent with the characteristics of mitochondrial base bias in metazoan animals.The genetic distance between the species was 0.000～0.050,the interspecific genetic distance was 0.194-0.366,the genetic distance between C.acuta and D.dehaanis was the highest(0.366),C.feriatus and C.japonica had the lowest genetic distance(0.194).The Neighbor-Joining(NJ)phylogenetic trees using adjacent method showed that the species of Charybdis spp.were clustered first,and then clustered with Portunus spp.belonging to Portunidae,and finally clustered with Dromiidae species,which consistent with the corresponding crab morphological classification results.

crabs;mitochondrial DNA;cytochrome b;phylogeny

Q959.233

A

2096-4730(2017)04-0315-05

2017-04-20

舟山市公益类科技项目（2015C31013）

王娜泠（1992-），女，重庆市人，硕士研究生，研究方向：种质与种苗工程.E-mail：naling_wang@163.com

柴学军（1972-），男，教授级高工，研究方向：鱼类繁育与海洋生物技术.E-mail：chaixj6530@sohu.com