筛选具有淀粉酶活力的菌株及其诱变

崔云龙

（嘉吉生化有限公司，吉林松原 138000）

筛选具有淀粉酶活力的菌株及其诱变

崔云龙

（嘉吉生化有限公司，吉林松原 138000）

利用筛选培养基在吉林农业大学1号稻草中筛选出1株具有淀粉酶活性的芽孢，再利用紫外线（波长254nm）对出发菌株10号进行诱变处理，诱变后记录致死率，分别为54.24%、69.07%、72.88%、86.02%、88.98%、91.95%。再用DNS法检测酶活力，通过吸光度计算确定150s产多糖最多，为最佳诱变时间。最高活力酶的产糖量为14.4U，此时致死率为88.98%，比原菌株还原糖产量增长114.3%。

紫外诱变；筛选；淀粉酶

淀粉酶（amylase）是在高温高压的条件下，作用于淀粉、糖元等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的酶[1]。根据水解的方式不同可分为α-淀粉酶（EC3.2.1.1.）与β-淀粉酶（EC3.2.1.2．）[2-3]。α-淀粉酶广泛存在于动物的唾液、胰脏，植物的麦芽及微生物中[4]。微生物产生的酶大部分都是分泌性的[5]。

玉米在世界的粮食生产中占有相当重要的地位。目前，玉米产品用途广泛，其在国内外加工业中已达数千个品种，食品、工业生产处处可见玉米的身影；玉米深加工产品已发展到多个层次，随着科技的发展和自动化的应用，所加工出的产品广度和深度日益加深，使得经济和实用价值不断增加。

芽孢菌在较为恶劣的情况下，可以形成特定的休眠体——抗逆性芽孢，芽孢本身的抗逆性所以具有顽强的生命力及对特定环境的适应能力，借助于基因组的破译和遗传系统的建立，使之成为较为固定的载体。目前，国内外主要利用微生物培养筛选来生产淀粉酶。虽然各种微生物也能产生专一性葡聚糖酶，但绝大多数菌株的酶系对大多淀粉酶无特异性，能特异分解淀粉酶的菌株主要来源于芽孢菌属和曲霉属。但由于产量很低，难以实现工业化生产，本试验利用紫外线诱变处理芽孢菌10号期望能够得到多糖高产菌株，解决产量低的难题。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种由吉林农业大学1号稻草中筛选筛选而出，共20株，选其中第10株作为本实验的菌种。

1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏1g，可溶性淀粉1g，琼脂20g，定容至1 000mL，调pH值为7.0，121℃灭菌30min。

平板固体培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10g，酵母膏1g，可溶性淀粉1g，琼脂20g。定容至1 000mL，调pH值为7.0，121℃灭菌30min。

液体培养基：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏1g，可溶性淀粉10g。定容至1 000mL，调pH值为7.0，121℃灭菌30min。

1.3 仪器设备及药品

仪器设备：超净工作台、恒温摇床、常速离心机、紫外灯、红灯、高压灭菌锅、电子天平、试管若干、恒温培养箱、水浴锅、电炉、干燥箱、722分光光度仪等。

所用药品：葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、琼脂、NaOH、吉林农业大学1号稻草、3,5-二硝基水杨酸试剂等。

1.4 实验方法

1.4.1 菌株的筛选

将收集来的吉林农业大学1号稻草用蒸馏水浸泡24h后，取出浸泡液煮沸2min，将浓度稀释到10-4，均匀地涂布在平板培养基上，37℃倒置培养12h，存活的即为芽孢杆菌。分别接入到5mL液体培养基中，37℃恒温培养箱中培养12h。之后进行酶活力的初步检测。确定活力最佳的菌株为第10号，用该株进行诱变。

1.4.2 划线培养

取活化后的斜面菌种10号，接种于平板固体培养基上，37℃倒置培养12h。

1.4.3 诱变前菌液稀释浓度的确定

菌株平板培养12h后，挑单菌落接入装有5mL液体培养基的试管里，37℃恒温培养箱12h。稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，再经过涂平板培养12h后，10-6、10-7、10-8出现单斑，10-7为最佳诱变浓度。

1.4.4 紫外诱变

菌株平板培养12h后，选择单独菌落利用液体培养基试管内培养，恒温37℃培养12h。稀释到原浓度的10-7涂平板，每个平板用量为0.1mL，共准备7份，将培养皿置于波长为254nm约l5W紫外灯下20cm处。照射时间分别为30s、60s、90s、120s、150s、180s。37℃恒温培养箱中避光倒置培养12h。进行菌落计数，上述操作进行3次，取平均值，计算至死率。

1.4.5 恒温发酵培养方法

在对照平板和诱变后的平板中分别挑取与出发菌株相比较菌落直径大、周边呈稠厚状者为生长与产还原糖性能较优良的纯种的菌落。一部分用于接种斜面培养基保留菌种，另一部分接种于装有5mL液体培养基的试管中，进行培养。培养条件37℃恒温培养箱12h。

1.5 分析方法

1.5.1 葡萄糖浓度分析

葡萄糖浓度采用光度法分析。标准曲线绘制：将少许分析纯（AR）葡萄糖（约1g）放在一个小的表面皿内放入烘箱，100℃干燥30min。取出后放在一个小干燥器内，冷却。准确称量1.000g去水恒重的葡萄糖，溶解，稀释并定容到500mL，此标准液的浓度为0.2%。

取11支刻度试管，加入0.2%葡萄糖溶液、水及3,5-二硝基水杨酸试剂，上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即用冰水冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度植为纵坐标绘制标准曲线图，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

1.5.2 酶活力的测定

将上述各诱变时间段的菌液3 000r/min离心取上清液0.1mL，加入到1%可溶性淀粉溶液2mL中，浸提在37℃水浴中保温30min，每5min振荡一次。取出后在沸水浴中加热5min后冷却到室温，再加入3,5-二硝基水杨酸试剂3mL。在沸水浴中加热5min后冷迅速冷却到室温，定容至25mL，测OD值。结果依次为0.172、0.161、0.155、0.185、0.177、0.192、0.173。根据吸光度确定最佳诱变时间及最大活力菌株。

2 结果与分析

2.1 紫外照射对菌株诱变的影响

在波长254nm条件下，不同时间的紫外照射，出发菌株10号芽孢菌的诱变死亡率如图2所示。

图2 致死率曲线

由图2可见，随着紫外线照射时间的延长，即处理剂量的增大，菌体的死亡率逐渐提高，图2中时间150s处最高。为了提高孢子的诱变率，所以确定150s为最佳的诱变时间。

2.2 紫外照射对菌株诱变后的淀粉酶活力的影响

在不同诱变时长的紫外照射，出发菌株10号杆菌在诱变后的淀粉酶活力如图3所示。

图3 酶活力曲线

图3可得出，正向突变共出现了两个峰值，呈现曲线的趋势。在150s时最高达到14.4U（U=葡萄糖浓度×稀释倍数/反应时间）。紫外线的照射时间与菌株的致死率、正突变存在着一定的剂量效应关系，随着照射时间的延长，致死率会逐渐提高，正突变也会随之相应的变化。诱变率高，致死率也相对高，为了提高孢子的诱变率，所以选择相对较高的致死率，所以也可确定150s为最佳的诱变时间。

3 结论

紫外线诱变是工业生产中最常用的诱变方法之一。其诱变效应主要是由于它引起DNA的结构改变，阻碍DNA的复制或引起碱基排列次序的变化，从而引起基因突变。从紫外线诱变选育突变株到液体培养、检测酶活，整个试验有很多需要注意的问题，由于吸光率可以直接反映出该菌株产多糖的性能，所以在试验过程中应充分考虑到各种影响因素，减少误差，以保证所得结果的准确性和可靠性。在操作过程中，尤其在进行紫外线诱变时，要保证不染菌，诱变时间准确，诱变距离相同。在接液体培养时，接菌要单一，接菌量相同，选择长势良好的菌株，培养时要避光，温度湿度要掌握好，培养时间也要相同，减少误差。

[1]钟万芳,万继朝,郭慧芳,等.广谱高效Bt菌株的筛选及杀虫蛋白基因的克隆[J].华南农业大学学报,2005,26(4):40-42.

[2]吴继星,陈在佴,张志刚.苏云金杆菌WG-001工程菌发酵培养基的筛选[J].微生物学杂志,2005,25(3):91-94.

[3]Reichert J M,Paquette C.Clinical development of therapeutic recombinant proteins[J].Biotechniques,2003,35(1):182-185.

[4]金明飞,朱欣华,金丽,等.利用degQ基因提高枯草芽孢杆菌纤溶酶表达[J].微生物学报,2005,32(2):69-72.

[5]Turnbull P C B.Current status of immunization against anthrax:old vaccines may be here to stay for a while[J].Curr Opin I nfect Dis,2000,13(2):113-120.

Sieving the Starch of Amylase Vigor and its Mutagenesis

Cui Yun-long
(Cargill Bio-Chemical Co.,Ltd,Jilin Songyuan 138000)

Using the screening culture medium to screen the bud spore which has the amylase vigor in JiLin Agricutural College 1 straw.Then using ultraviolet ray(wave length254nm)to mutate the embarksstrain.bud pore fungus 10,after mutagenesis,recording the lethality ratios is 54.24%，69.07%，72.88%，86.02%，88.98%，91.95%using DNS law to examine the enzyme vigor again,through absorbance computation,determined 150s produce the polysaccharide to be most,150s is the best mutagenesis time .The sugar quantity which produced by the highest vigor enzyme is 14.4U,this time the lethality ratios is 88.98%.The strain is better than the embarksstrain,its reducing sugar production has enhanced to 114.3%.

UV mutagenesis;Extraction;Amylase

TQ925 文献标志码：A

2096-0387（2017）06-0032-03

崔云龙（1985—），男，吉林敦化人，本科，助理工程师，研究方向：淀粉及淀粉糖产品。