酵母型生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化

陈成，钟雨雪，夏祥，邱成书，陈存，谢翼飞＊

（1.成都师范学院化学与生命科学学院，四川成都611130；2.中国科学院成都生物研究所，四川成都610041）

酵母型生物絮凝剂产生菌的筛选及培养基优化

陈成1，钟雨雪1，夏祥2，邱成书1，陈存1，谢翼飞2＊

（1.成都师范学院化学与生命科学学院，四川成都611130；2.中国科学院成都生物研究所，四川成都610041）

目的：获得高效的酵母菌型絮凝剂。方法：以代表性的高岭土悬浊液、养殖场废水、土壤上清液、藻液、硫酸铜溶液、发酵废水作为测试废水，筛选具有絮凝活性的菌种。结果：筛选出3株具有絮凝活性的菌种，其中酵母1-4絮凝效果较好且适用范围较广；对酵母1-4菌培养基的碳源、氮源、碳氮比进行优化，确定最适碳源为甘露醇，最适氮源为氯化铵，碳氮比5∶1为最佳。结论：用醇降法提取优化培养所得的絮凝剂，产率为5.0g/L，经紫外吸收光谱和茚三酮反应初步判断絮凝剂的主要成分为蛋白质。

酵母菌；生物絮凝剂；高岭土悬浊液；培养基优化

生物絮凝剂是一类天然高分子絮凝剂，是通过微生物发酵、分离提取而得到的一种高效、无毒且易降解的新型污水处理剂[1]。与传统絮凝剂相比，具有安全性高、生物降解性良好、易于固液分离、无二次污染、用量少等优点[2-5]，能快速絮凝各种颗粒物质，广泛用于去除水体中的悬浮物质[6]、COD[7]、重金属[8-9]、腐殖酸[10]等，在废水脱色、高浓度有机物去除等方面效果显著[11-13]，有着很大的研究价值和应用前景。

我国对生物絮凝剂的研究起步相对较晚，目前多数处于菌种的筛选阶段。虽然生物絮凝剂在水处理方面有着突出的优越性，但从规模化生产和应用角度来看，还存在着一系列亟待解决的问题，如高效絮凝剂产生菌的筛选和培育、絮凝活性的提高、寻找廉价的培养基等。研究发现，能够产生絮凝剂的微生物种类繁多，包括细菌、放线菌、真菌、霉菌、酵母菌和某些藻类等[14]，但现有的研究以细菌为主，对酵母型生物絮凝剂研究相对较少。不同菌种产生的絮凝成分差别较大，而不同的培养条件也会对絮凝效果和产量产生较大的影响。本文以酵母型絮凝剂产生菌为研究对象，在筛选生物絮凝剂产生菌株的基础上，采用高岭土悬浊液模拟待处理的废水，对高活性菌株的培养基进行优化，力求获得高效高产量的酵母型产絮菌及培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无水乙醇（AR，上海精细化工试剂有限公司）、酵母膏（BR，北京奥博星生物）、胰蛋白胨（BR，北京奥博星生物）、YPD培养基（BR，北京奥博星生物）、CuSO4（AR，天津美琳），其余试剂皆购于天津市科密欧化学试剂有限公司，纯度为分析纯。

1.2 仪器与设备

高速离心机：蜀科TG-16；电子天平：梅特勒-托利多A1-104；六联搅拌器：磁力数显控温搅拌器HJ-6A；电热恒温培养箱：DHP-600；恒温振荡器：IS-R0V1；pH计：雷磁PHB-4；双光束紫外可见分光光度计：普析TU-1901。

1.3 方法

1.3.1 高效酵母型生物絮凝剂产生菌的筛选

YPD培养基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉 20g、H2O 1 000mL，115℃灭菌 30min。

发酵培养基：葡萄糖20.0g、蛋白胨0.5g、酵母膏 0.5g、(NH4)2SO40.2g、K2HPO45.0g、KH2PO42.0g、MgSO40.2g、NaCl0.1g、1 000mL，pH=8.0，115 ℃ 灭菌30min。

种子培养基：蛋白胨5.0g、酵母膏15.0g、氯化钠4.0g、葡萄糖 10.0g、H2O 1 000mL、pH=7.0，115℃灭菌30min。

将实验室保存的酵母菌种接种到YPD培养基，28℃恒温活化培养10h后接种到50mL液体发酵培养基，28℃、180r/min振荡培养24h。向6个烧杯中分别加入高岭土悬浊液、养殖场废水、CuSO4溶液、发酵废水、藻液、土壤上清液各20mL，再分别加入0.2mL发酵液，1mL1%CaCl2，快速搅拌1min，慢速搅拌4min，观察絮凝效果。

1.3.2 培养基优化

（1）碳源优化。分别以淀粉、甘露醇、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖作为碳源，将菌种接入种子培养基，28℃180r/min恒温振荡培养10h。取菌液接种到发酵培养基培养24h后，以20mL高岭土悬浊液为测试液，加入1mLCaCl2混匀后静置10min，测定上清液在550nm下的吸光度（OD550）。将菌液稀释10倍后，测定其在600nm下的吸光度（OD600）。

（2）氮源优化。分别以(NH4)2SO4、尿素、酵母膏、酵母膏尿素混合物、NH4Cl作为氮源，在碳源最优条件下，其余操作同上。

（3）碳氮比优化。调节C/N比分别为10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10进行发酵培养，在碳源、氮源最优条件下，其余操作同上。

1.3.3 絮凝剂成分的分析

向150mL预冷的无水乙醇中加入50mL发酵液，于-4℃条件下静置8h，6 000r/min离心20min，弃去上清液，将沉淀放于烘箱中用40℃烘干至恒重。所得絮凝剂用紫外可见分光光度计扫描其吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 高效酵母型絮凝剂产生菌的筛选

实验分离纯化出酵母型菌株20株，以高岭土悬浊液、养殖场废水、CuSO4溶液、发酵废水、藻液、土壤上清液6种代表性废水做筛选，选出的菌种絮凝效果实用性与适用性比单一废水筛选更强。实验结果见表1。酵母1-4、酵母1-7、酵母1-8有明显的絮凝活性，三者絮凝情况对比如图1所示。可以看出，酵母1-4菌对土壤上清液、藻液、高岭土悬浊液等都有明显的效果，适用范围较广，且絮凝效果优于酵母1-7与酵母1-8。

2.2 培养基优化

以絮凝效果最好的酵母1-4菌为菌种优化发酵培养基配方。碳源优化结果见表2，OD550越小上清液越澄清，发酵液絮凝效果越好，OD600数值越高表明发酵液中菌种生长状况越好。以甘露醇作为碳源，OD550数值最低，絮凝效果最好，其OD600数值仅次于葡萄糖，菌种生长状况较好。因而，兼顾絮凝效果与菌种生长情况，确定甘露醇为最适碳源。

表1 菌株絮凝效果

图1 三株酵母菌的絮凝效果

表2 碳源优化结果

以甘露醇作为碳源，(NH4)2SO4、尿素、酵母膏、酵母膏尿素混合物、NH4Cl作为氮源，絮凝效果和菌种生长情况见表3。以NH4Cl作为培养基氮源，测得OD550最低，絮凝效果最好，OD600数值最高，菌种生长状况最好。因而确定NH4Cl作为最佳氮源。

表3 氮源优化结果

在碳源为甘露醇，氮源为NH4Cl的条件下，优化培养基的碳氮比，测得OD550、OD600值见表4。比较可得当碳氮比为5∶1时，OD550最低，OD600最高，絮凝效果最好且菌种生长状况最好。故优化后的发酵培养基的碳源为甘露醇，氮源为NH4Cl，碳氮比为5∶1。

表4 碳氮比优化结果

2.3 絮凝剂成分的初步鉴定

采用醇降法分离提取优化培养24h的酵母1-4菌所产出的絮凝剂，测得产量为每50mL发酵液0.25g。利用紫外可见分光光度计测得絮凝剂于260nm处有吸收峰，茚三酮反应呈紫色，可初步确定酵母1-4菌株产生的絮凝剂主要成分为蛋白质。

3 结论

从实验室保藏菌种中分离纯化出的20株酵母菌，并筛选出3株具有较好絮凝效果的酵母菌，即酵母1-4、酵母1-7、酵母1-8，其中酵母1-4絮凝效果最优且适用范围更广。以酵母1-4菌为菌种优化发酵培养基配方，考虑絮凝效果与菌种生长情况下，优化后发酵培养基的碳源为甘露醇，氮源为NH4Cl，碳氮比为5∶1。采用醇降法分离提取酵母1-4产出的絮凝剂，产量为每50mL发酵液0.25g。利用紫外可见分光光度计测得絮凝剂于260nm处有吸收峰，且茚三酮反应呈紫色，证明絮凝剂主要成分为蛋白质。

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Screening and Medium Optimization of High-efficiency Flocculant-producing Yeast

Chen Cheng1,Zhong Yu-xue1,Xia Xiang2,Qiu Cheng-shu1,Chen Cun1,Xie Yi-fei2*
(1.School of Chemistry and Life Science,Chengdu Normal University，Sichuan Chengdu 611130;2.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Sichuan Chengdu 610041)

Objective:To obtain an efficient yeast flocculant.Methods:the flocculation activity test for kaolin suspension,farm wastewater,soil supernatant,algae solution,copper sulfate solution and fermentation wastewater.Results:Three flocculant-producing yeasts were screened,in whichYeast1-4 has the highest flocculation efficiency and could be applicable to for more kinds of wastewater.The medium constituents of Yeast1-4 was optimized and the results showed that,the optimum carbon source was mannitol,the optimum nitrogen source was ammonium chloride and the optimum C/N ratio was 5∶1.Conclusion:Under this conditions,the flocculantyield of Yeast1-4 is 5.0g/L.The main ingredient of flocculant is identified to be protein by UV spectroscopy andninhydrin reaction.

Yeast;Bioflocculant;Kaolin suspension;Medium optimization

X172 文献标志码：A

2096-0387（2017）06-009-04

四川省教育厅科研项目（17ZB0072）；四川省大学生创新创业训练计划（107260127）。

陈成（1984—），女，四川南充人，博士在读，讲师，研究方向：水处理技术。

谢翼飞（1977—），男，江苏武进人，博士，副研究员，研究方向：环境微生物。