从肠道菌群多样性探讨越鞠丸对ApoE-/-小鼠血脂的影响❋

李玉波，郝改梅，贾海骅，王国为，黄 媛，李志更△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2. 广西药用植物园，南宁 530023)

【实验研究】

从肠道菌群多样性探讨越鞠丸对ApoE-/-小鼠血脂的影响❋

李玉波1，郝改梅1，贾海骅1，王国为1，黄 媛2，李志更1△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2. 广西药用植物园，南宁 530023)

目的：观察治疗六郁的代表方越鞠丸对血脂的影响，为临床应用和实验研究提供参考依据。方法：采用高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠的方法建立动脉粥样硬化斑块模型，用越鞠丸和辛伐他汀分别对高脂饲料饲养的ApoE-/-小鼠进行干预，ELISA法检测小鼠血清血脂含量，基于16S rDNA基因测序技术分析小鼠肠道菌群。结果：越鞠丸组、辛伐他汀组和模型对照组小鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量明显高于正常对照组，高密度脂蛋白(HDL-C)含量明显低于正常对照组；越鞠丸组小鼠TC和LDL-C含量明显低于模型对照组且与辛伐他汀组比较差异无统计学意义，TG和HDL-C含量与模型对照组比较差异无统计学意义。越鞠丸组与正常对照组、模型对照组、辛伐他汀组小鼠粪便样本菌群存在显著性差异，模型对照组与辛伐他汀组小鼠粪便样本菌群比较差异无统计学意义。结论：越鞠丸能降低TC和LDL-C，其机制与辛伐他汀不同，越鞠丸可能通过抑制红蝽菌科等4类细菌和促进双歧杆菌科等5类细菌的生长来降低TC和LDL-C。

肠道菌群；越鞠丸；血脂

近年来，中医学对动脉粥样硬化斑块的研究提出了“瘀”“脂”“热毒”学说以及“阴虚毒瘀”“风邪内动、血脉痉挛”等假说[1-3]，但未能形成共识的治疗方法，如何用中药稳定斑块仍是当前研究的热点。有学者认为，早期气郁可导致高脂血症，病位在肝胆脾，日久而见湿痰瘀热食郁，从而形成动脉粥样硬化斑块[4-5]。也有学者认为，动脉粥样硬化斑块的发生与气、血、痰、湿、食、火六邪郁滞(六郁)相关[6-7]。现代医学已研究发现，肠道菌群可以代谢磷脂类和胆碱类产生胆碱、氧化三甲胺和甜菜碱，而这些代谢产物能够引发动脉粥样硬化[8]。本研究采用高脂饮食喂养ApoE基因敲除小鼠的方法建立动脉粥样硬化斑块模型，观察治疗六郁的代表方越鞠丸对其血脂的影响，并基于肠道菌群多样性研究初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6周龄SPF级雄性APOE-/-小鼠60只，体质量15～20 g，由北京维通利华生物技术有限公司提供，高脂饲料也由此公司提供。小鼠按随机数字表法分成正常对照组、模型对照组、越鞠丸组、辛伐他汀组4组各15只。本试验经过中国中医科学院中医基础理论研究所伦理审查委员会的许可。

1.2 药物剂量及给药方法

越鞠丸组成：醋香附10 g，川芎10 g，炒栀子10 g，炒苍术10 g，炒神曲10 g。人(60 kg)与小鼠(0.02 kg)间用药剂量折算系数为9.01，按照成人60 kg/d的用药剂量醋香附、川芎、炒栀子、炒苍术、炒神曲各10 g，转化为0.02 kg/d小鼠原始剂量为醋香附、川芎、炒栀子、炒苍术、炒神曲各0.03 g。根据每味中药免煎颗粒剂量与原始剂量之间的换算关系，按照每只大鼠体质量分别称取醋香附、川芎、炒栀子、炒苍术、炒神曲免煎颗粒若干，混合后用20 ml无菌纯净水溶解，免煎颗粒由北京同仁堂东四十条药店提供。

辛伐他汀(舒降之)由杭州默沙东制药有限公司提供，按照成人60 kg/d的用药剂量20 mg转化为0.02 kg/d小鼠原始剂量0.06 mg，将20 mg辛伐他汀片剂研磨成粉后用66.66 ml无菌纯净水制成悬浊液。

正常对照组小鼠正常饲料饲养，每日每只灌胃0.2 ml生理盐水；模型对照组小鼠高脂饲料饲养，每日每只灌胃0.2 ml生理盐水；越鞠丸组小鼠高脂饲料饲养，每日每只灌胃0.2 ml越鞠丸免煎颗粒；辛伐他汀组小鼠高脂饲料饲养，每日每只灌胃0.2 ml辛伐他汀悬浊液。

1.3 动脉粥样硬化斑块模型的确立

高脂饲料饲养模型对照组、越鞠丸组和辛伐他汀组小鼠14周后，从每组中随机抽取5只小鼠取材，观察其主动脉窦部和头臂干动脉是否有粥样硬化斑块，如果全部都有则认为动脉粥样硬化斑块模型确立，根据课题组前期预实验的结果，高脂饲料喂养14周后模型可确立。

1.4 收集粪便和血清样本

4组小鼠饲养14周后取材，取材前1 d收集各组大鼠的新鲜粪便，每组每次选取10个样本，重复3次(早7点至晚23点，每次间隔8 h)共计120个样本。取材时鼠经10%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血1 ml，离心后取血清，共计40个样本。所有粪便和血清样本均置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 DNA提取

粪便标本解冻以后，按照粪便基因组DNA快速提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)的操作手册逐步操作，提取细菌DNA。使用紫外分光光度计测定DNA的浓度，吸取5 μL所提取的DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析其质量和数量。

1.6 PCR扩增

进行细菌16SrDNA V3-V4可变区PCR扩增，引物选择16S-F/16S-R(5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’ / 5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’，北京奥维森基因科技有限公司合成)。PCR采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA Polymerase。全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3次重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱,2%琼脂糖电泳检测。

1.7 荧光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量。

1.8 Miseq文库构建和上机测序

由北京奥维森基因科技有限公司完成。

1.9 ELISA法检测3组小鼠血清血脂含量

小鼠血脂4项(血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)ELISA试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，ELISA具体流程按试剂盒说明进行。

1.10 统计学方法

小鼠血清血脂含量采用随机区组方差分析。alpha多样性指数采用秩和检验，群落结构分析采用Anosim相似性分析。Anosim[9]相似性分析也是一种非参数检验，用来检验组间( 2组)的差异是否显著大于组内差异以及差异是否具有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠高脂饲料喂养14周后血清血脂含量

正常对照组小鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C含量明显低于其他3组。辛伐他汀组小鼠血清TC、TG、LDL-C含量明显低于模型对照组，HDL-C含量明显高于模型对照组。越鞠丸组小鼠血清TC和LDL-C含量明显低于模型对照组，与辛伐他汀组比较差异无统计学意义，TG和HDL-C含量与模型对照组比较差异无统计学意义。

2.2 肠道菌群多样性分析

2.2.1 优质序列长度分布 图1显示，本试验共采集到120个小鼠粪便样品，所测序列长度大多分布在360～480 bp，与所测的16S rDNA的V3-V4区条带长度大致相符。

2.2.2 Specaccum物种累积曲线 Specaccum物种累积曲线结果反映了持续抽样下新OTU(新物种)出现的速率。在一定范围内，随着样本量的加大，若曲线表现为急剧上升，则表示群落中有大量物种被发现；当曲线趋于平缓，则表示此环境中的物种并不会随样本量的增加而显著增多。根据图2可知，本次试验选择的样本量是充足的。

表1 3组小鼠高脂饲料喂养14周后血清血脂含量(mmol/L)

注：与正常对照组比较：△P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05；与辛伐他汀组比较:★P<0.05

图1 优质序列长度分布(横坐标为tags梯度，纵坐标为tag数量)

图2 Specaccum物种累积曲线(横坐标：样本量；纵坐标：抽样后OTU数目。)

2.2.3 alpha多样性指数 群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析(Alpha多样性)可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种多样性。表2图3显示，经过最低序列数样本数抽平分析，越鞠丸组和辛伐他汀组小鼠肠道菌群多样性明显多于模型对照组，其中越鞠丸组小鼠肠道菌群多样性还明显多于辛伐他汀组。

表2 alpha多样性指数

注：与正常对照组比较：△P<0.05；与模型对照组比较：▲P<0.05；与辛伐他汀组比较:★P<0.05

图3 alpha多样性指数box图注：Chao1即菌种丰富度指数，用以估计群落中的OTU数目；goods_ coverage反映的是本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况；observed_species指实际观测到OTU的个数；PD_Whole_Tree是基于系统发生树来计算的一种多样性指数；Shannon用来估算样品中微生物多样性指数，shannon值与群落多样性成正相关

2.2.4 Anosim分析结果 表3显示，4组数据经两两比较，R值均大于0，说明组间差异显著。从P值来看，正常对照组与模型对照组、越鞠丸组和辛伐他汀组小鼠粪便样本菌群存在差异，模型对照组与辛伐他汀组小鼠粪便样本菌群比较差异无统计学意义。

表3 3组数据两两Anosim分析比较

注：R-value介于(-1，1)之间，R值大于0，说明组间差异大于组内差异；R值小于0，说明组内差异大于组间差异，统计分析的可信度用P值表示，P<0.05为差异有统计学意义

2.2.5 群落结构分析 表4显示,经过Anosim分析，将3组样本中存在差异的菌群进行归纳，越鞠丸组小鼠粪便样本的微生物菌群数量在放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、柔磨菌门、疣微菌门的部分纲、目、科与模型对照组和辛伐他汀组比较差异显著。与模型对照组比较，越鞠丸组小鼠肠道红蝽菌科、拟杆菌科、普雷沃氏菌科、S24-7科、动性球菌科、肉杆菌科、丹毒丝菌科、产碱杆菌科、气单胞菌科、疣微菌科菌群数量明显减少，双歧杆菌科、理研菌科、乳杆菌科、毛螺菌科、消化链球菌科、瘤胃菌科、脱硫弧菌科、产氢细菌目菌群数量明显增多，其中红蝽菌科、普雷沃氏菌科、S24-7科、气单胞菌科菌群数量明显低于辛伐他汀组，双歧杆菌科、理研菌科、乳杆菌科、毛螺菌科、产氢细菌目菌群数量明显高于辛伐他汀组。

表4 OTU分类学综合信息表(单位：个)

3 讨论

从3组小鼠高脂饲料喂养14周后血清血脂含量来看，辛伐他汀的效果最好，对TG、TC、LDL-C、HDL-C均有积极作用，但2013年中国食品药品监督总局(CFDA)发布修订他汀类药品说明书通知，提醒中国医生和患者关注他汀安全性[10]。目前辛伐他汀潜在的不良反应主要有肌病[11-12]、转氨酶升高[10]、增加新发糖尿病风险[13-14]等。相比较而言，越鞠丸虽然只对TC和LDL-C有积极作用，且与辛伐他汀比较差异无统计学意义，但是越鞠丸在临床应用上未见不良反应报道，具有一定的优势。

辛伐他汀为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，为血脂调节剂，其作用的通路和靶点较为明确。但从本实验结果来看，其对肠道菌群的影响不明显。越鞠丸是治疗六郁的代表方剂，六郁常因饮食不节、寒温不适、喜怒无常、忧思无度、气机运行失常而发病。肝喜条达，怒气伤肝，气郁则胸膈痞闷；肝藏血，气郁者血瘀出现胸胁痛或月经不调、痛经等；肝与胆互为表里，为相火寄居之所；气郁化火则口苦泛酸，此气、血、火郁在肝胆，肝病及脾，使脾失运化，导致湿郁、痰郁；不能运化水谷则食郁；食、痰、湿三者壅滞中焦，则胀满不食、吞酸呕吐诸症丛生；此证虽有气、血、火、湿、痰、食六郁，而实际多为肝脾郁结为病。中医学的肝脾与现代医学的消化系统内涵相近，而肠道菌群在消化过程中发挥着重要作用。越鞠丸的作用通路和靶点虽然尚不明确，但本研究表明其对肠道菌群有明显的改变，说明辛伐他汀和越鞠丸降低血脂的作用机制是不同的。

人类肠道微生物菌群超过3500种[15]，肠道细菌中95%以上可归为厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门[16]。越来越多的循证研究表明，AS患者的肠道菌群失衡，其中双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌明显减少，而大肠杆菌、链球菌、幽门杆菌等明显增加[17-19]。现代基础研究中， Xie等[20]研究表明乳杆菌能显著降低高脂饲料喂养鼠的血总胆固醇水平；陈丽华[21]的研究结果发现，乳酸杆菌能降低ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成面积；Chen等[22]研究发现，高胆固醇大鼠模型喂饲双歧杆菌与低聚糖14 d后，动物血清TC、TG降到基本正常水平。本研究从肠道菌群分析结果看，越鞠丸能促进双歧杆菌科、乳杆菌科和毛螺菌科细菌的生长，从而对动脉粥样硬化产生有益作用，这与文献报道一致。对于越鞠丸作用的其他菌科，放线菌通过产生各种生物活性物质参与宿主代谢以及维持宿主肠道微生态平衡等一系列重要的生理活动；拟杆菌对多糖的利用方面作用尤为突出；厚壁菌门中芽孢杆菌纲中的芽孢杆菌目和肉杆菌科包含致病菌，但乳杆菌科细菌能发酵分解糖代谢，终产物中50%以上是乳酸罕见致病，其梭菌纲细菌可以水解糖和蛋白质，其丹毒丝菌纲细菌糖发酵能力较弱且包含致病菌；变形菌门的形状具有极为多样的形状，β变形菌和γ变形菌均为致病菌，但δ变形菌能脱硫或者还原硫、还原三价铁罕见致病。柔膜菌门细菌对动植物残体分解起着十分重要的作用，有益生菌也有致病菌，其产氢细菌目中的细菌能够利用分子态氢和氧之间反应所产生的能，在动物肠道中的具体作用尚不明确；疣微菌门对肥胖症和2型糖尿病的发病具有重要作用。关于以上细菌的相关文献，目前报道较少，因此本研究的结果具有一定的开拓性。

肠道微生态与中医理论存在相关性。生物与环境统一论是微生态学的基本观点，这与中医学的核心观点整体观具有统一性。同时微生态平衡理论与中医学阴阳平衡理论、微生态学的微生态调节论与中医学的调整阴阳扶正祛邪理论具有相通性[23]，因此肠道微生态原理与中医基础理论的一致性可以使其成为中医理论与现代医学研究的切入点。本研究表明，中医基础理论指导下的经典方越鞠丸降血脂的机制与辛伐他汀不同，越鞠丸可能通过抑制红蝽菌科、普雷沃氏菌科、S24-7科、气单胞菌科细菌和促进双歧杆菌科、理研菌科、乳杆菌科、毛螺菌科、产氢细菌目细菌的生长起到降低TC和LDL-C的作用，且越鞠丸无不良反应报道，安全性较辛伐他汀高，充分体现出中医治病的优势，同时证明在降脂方面中草药的应用能减少他汀类化学药物的使用，降低他汀类化学药物的风险。

[1] 周明学，徐浩，陈可冀. 中医脂毒、瘀毒与易损斑块关系的理论探讨[J].中国中医基础医学杂志，2007，13(10)：737-738.

[2] 彭立. 易损斑块与阴虚毒瘀病机相关理论的探讨[J]. 中华中医药学刊，2009，27(5)：970-971.

[3] 张金生. 关于构建易损斑块中医病理机制“微型毒瘀痰”理论的思考[J]. 中国中药杂志，2011，36(19)：2744-2746.

[4] 涂晓龙. 六郁论脂[J]. 辽宁中医杂志, 2010，37(1)：64-67.

[5] 朱吉安. 以丹溪六郁学说论治高脂血症的临床研究[D].济南：山东中医药大学，2012：14-18.

[6] 赵含森，苏毅馨，蔡敏，等. “六郁同治”法对动脉粥样硬化易损斑块ApoE-/-模型小鼠脂代谢及高敏C反应蛋白的影响[J]. 2014，33(1)：54-57.

[7] 赵含森，郭玲. 冠心病不稳定型心绞痛的中医六郁相关学说[J].中国中医药信息杂志，2007，14(4)：4-5.

[8] WANG Z, KLIPFELL E, BENNETT BJ, et al. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease[J]. Nature, 2011, 472(7341): 57-63.

[9] CLARKE K R. Non-parametric multivariate analysis of changes in community structure[J]. Australian Journal of Ecology,1993,18:117-143.

[10] 他汀类药物安全性评价工作组. 他汀类药物安全性评价专家共识2014[J]. 中华心血管病杂志, 2014, 42(11)：890-894.

[11] LAW M, RUDNICKA AR. Statin safety:a systematic review[J]. Am J Cardiol, 2006, 97: 52C- 60C.

[12] STROES ES, THOMPSON PD, CORSINI A, et al. Statin-associated muscle symptoms: impact on statin therapy-European Atherosclerosis Society Consensus Panel Statement on Assessment, Aetiology and Management[J]. Eur Heart J, 2015, 36(17): 1012-1022.

[13] PREISS D, SESHASAI SR, WELSH P, et al. Risk of incident diabetes with intensive-dose compared with moderate- dose statin therapy: a Meta-analysis[J]. JAMA, 2011, 305(24):2556-2564.

[14] CEDERBERG H, STANKOVA, YALURI N, et al. Increased risk of diabetes with statin treatment is associated with impaired insulin sensitivity and insulin secretion: a 6-year follow-up study of the METSIM cohort[J]. Diabetologia, 2015, 58(5):1109-1117.

[15] FRANK DN, ST AMAND AL, FELDMAN RA, et al. Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(34): 13780-13785.

[16] BENSON AK, KELLY SA, LEGGE R, et al. Individuality in gut microbiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(44): 18933-18938.

[17] WANG Z, KLIPFELL E, BENNETT BJ, et al．Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease [J]. Nature, 2011, 472(7341): 57-63.

[18] KARLSSON C, AHRNé S, MOLIN G, et al. Probiotic therapy to men with incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a randomized controlled trial[J]. Atherosclerosis, 2010, 208 (1): 228-233.

[19] 王玲, 李群. 冠心病患者肠道菌群分布及其与尿酸代谢的关系分析[J]. 现代消化及介入诊疗, 2012, 17(6): 327-330．

[20] XIE N, CUI Y, YIN YN, et al. Effects of two Lactobacillus strains on lipid metabolism and intestinal microflora in rats fed a high-cholesterol diet[J]. BMC Complement Altern Med， 2011, 3 (11): 53.

[21] 陈丽华. 乳酸杆菌对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响及机制研究[D]. 长沙：中南大学湘雅医院, 2013.

[22] CHEN HC, CHANG CC, MAU WJ, et al. Evaluation of N-acetylchitooligosaccharides As the main carbon sources for the growth of intestinal bacteria [J]. FEMS Microbiol Lett， 2002, 209 (1): 53-56.

[23] 张北平, 赵喜颖, 吴艺锋. 肠道微生态与中医理论相关性的研究进展[J]. 现代消化及介入诊疗, 2011, 16(4): 276-277.

EffectsofYueJuPillontheBloodLipidsofApoE-/-micefromIntestinalFloraDiversity

LI Yu-bo1, HAO Gai-mei1, JIA Hai-hua1, WANG Guo-wei1, HUANG Yuan2, LI Zhi-geng1△

(1.InstituteofBasicTheoryforChineseMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalScience,Beijing100700,China; 2.GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants,Nanning530023,China)

Objective: To observe the effect on blood lipids of Yueju pills, a representative formula of the SixYu, thus provide reference for clinical application and experimental study. Methods: The model of atherosclerotic plaque was established by feeding ApoE-/-mice with high-fat diet. Interventions include Yueju pills and simvastatin. Elisa was used to detect the serum lipid content in mice. The intestinal microflora was analyzed based on 16S rDNA gene sequencing. Results: Mice in Yueju pills group, simvastatin group as well as the model control group experienced higher level of serum cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein (LDL-C) and lower level of high-density lipoprotein (HDL-C) than those in the normal diet control group. TC and LDL-C levels of mice in Yueju pills group were lower than those in model control group but showed no significant difference compared with simvastatin group. In terms of triglyceride (TG) and high-density lipoprotein (HDL-C), Yueju pills group showed no statistically difference compared with model control group. There was a significant difference in the stool samples between Yueju pills group and the other groups, while the difference between the model control group and the simvastatin group was not significant. Conclusion: Yueju pills can reduce TC and LDL-C, whose mechanism is different from simvastatin. Yueju pills may reduce TC and LDL-C by inhibiting the growth of four kinds of bacteria such as Coriobacteriaceae, while promoting the growth of Bifidobacteriaceae and promoting growth of five other kinds of bacteria such as bifidobacterium.

Intestinal microflora; Yueju pills; Blood lipids

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(YZ-1539;YZ-1541)-加味越鞠丸对动脉粥样硬化的作用机制研究;越鞠保和丸对ApoE-/-小鼠消化功能及高脂血症的调节作用

李玉波(1986-)，男，湖北荆州人，助理研究员，医学博士，从事心血管及情志类疾病的中医药防治研究。

△通讯作者：李志更(1979-)，男，河北石家庄人，副研究员，医学博士，从事中医治则治法及养生学研究，Tel：010-64089032，E-mail：li-zhi-geng@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)11-1559-05

2017-04-17