慢性乙型肝炎患者肝组织中CD8 CD28表达与肝窦病变的关系

陈付凉，涂远航，徐长江，严家春



·论著·

慢性乙型肝炎患者肝组织中CD8 CD28表达与肝窦病变的关系

陈付凉1，涂远航2，徐长江1，严家春1

目的：探讨慢性乙型肝炎(CHB)肝组织中CD8，CD28在肝细胞中表达与肝窦病变的关系。方法：随机选择解放军第123医院肝病中心慢性乙型肝炎患者肝穿刺组织60例，穿刺肝组织采取免疫组化CD8，CD28双染色法，光镜观察其表达与肝窦病变的关系。结果：CD8，CD28阳性表达与肝窦狭窄、肝窦阻塞、肝窦扩张、肝窦毛细血管化密切相关。提示，肝窦病变较轻时以细胞毒性(杀伤性)T淋巴细胞CD8+，CD28+分子的表达占优势；调节性T淋巴细胞CD8+，CD28-分子少表达。随着肝组织炎症病变加重，炎症坏死区T淋巴细胞CD8+，CD28+分子的表达增强。而当肝组织肝窦毛细血管化较重，坏死修复并形成纤维间隔带或纤维瘢痕时则以抑制性(调节性)T淋巴细胞CD8+，CD28-分子表达为主。CD8，CD28分子在肝窦狭窄、阻塞、扩张、毛细血管化重度时表达均最高(P<0.01)。表明T淋巴细胞CD8，CD28分子的表达参与慢性乙型肝炎肝窦病变的病理转化。结论：慢性乙型肝炎肝组织中T淋巴细胞CD8，CD28分子的表达变化在肝窦病变的演变中担当一关键角色。

乙型肝炎，慢性； 肝组织； CD8； CD28； 肝窦

国内外学者对T淋巴细胞与肝炎的关系研究甚多，但多局限于外周血淋巴细胞的表达来间接反映肝组织的病变。笔者通过对60例CHB患者及10例正常对照组肝组织血管平滑肌肌动蛋白(a-SMA)免疫组织化学染色，CD8，CD28双染色，同时光学显微镜观察肝细胞肝窦的细微变化。提示慢性乙型肝炎(CHB)肝细胞CD8，CD28表达变化与肝窦病变密切相关。显示免疫反应不足或过强都会对肝窦及窦周隙造成不同的病理损坏。其表现有肝窦狭窄、扩张、阻塞、毛细血管化等一系列病变(后称肝窦病变)。本研究旨在观察肝组织中T淋巴细胞CD8，CD28分子表达与肝窦病变的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选择2011年7月-2015年7月解放军第123医院肝病中心CHB患者60例，男43例，女17例，年龄17～58岁，平均年龄35岁。B超引导下肝脏组织穿刺，获取的肝组织长度在1.5～2 cm之间。G1，G2的患者称为CHB轻度，G3，G4分别为CHB中度和重度患者[1]。60例CHB患者病理检查结果中，按炎症程度不同分为G1，G2，G3，G4。其中(G1)13例，(G2)15例，(G3)15例，(G4)17例。另选取正常肝组织10例(正常组)，排除HBAg阳性。所有病例诊断均符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订“病毒性肝炎防治方案”的诊断标准[1]，排除HAV，HCV，HDV和HVE感染，排除近3个月应用糖皮质激素、干扰素、胸腺素等影响免疫功能药物的患者，排除应用核昔类似物者，排除酒精性、药物性、感染中毒性肝损害的患者。

1.2 方法

1.2.1 试剂 免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。兔抗人CD8(CTL/TS)单克隆抗体购自无锡博慧斯生物医药科技有限公司。小鼠抗大鼠CD28 FITC荧光单克隆抗体购自上海雷浩信息科技有限公司。免疫组化双标记试剂盒为美国Zymed公司产品，免疫组化染色的过氧化酶标记选用莲霉卵白素试剂盒为美国Maxin Biotech Inc产品。

1.2.2 标本采集与处理 获得60例CHB患者肝组织经4%甲醛固定、脱水、包埋，4 μm连续切片，分别做苏木素-伊红染色，血管平滑肌肌动蛋白(a-SMA)免疫组化染色和CD8,CD28双染色，光镜观察。

1.2.3 免疫组化染色方法 标本石蜡切片使用二甲苯及梯度酒精脱蜡至水洗。每张切片使用50 μL过氧化物酶阻断溶液消除内源性过氧化物酶活性10 min。使用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，分别滴加兔抗人-CD8抗体和鼠抗-CD28抗体(1：1:50)。4℃冰箱过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，加入过氧化物酶标记的二抗，室温孵育25 min，每张切片加入NBT显色、AEC显色、DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。

1.2.4 肝细胞CD8 CD28分子阳性表达的判定方法[2]观察CD8,CD28在肝组织中单个核细胞的染色深浅及分布范围。不显色为阴性(-)。染成蓝黑色(CD8+)或红色(CD28+)呈散在分布为阳性(+)，染色细胞数每个高倍视野(400倍)单个核细胞≤20。单个高倍视野阳性部位细胞数>20，呈弥漫性或片状分布为强阳性(++)。每张切片随机选5个高倍镜视野，计算其阳性细胞数，取平均值。

1.2.5 肝窦病变的评定标准[3-4](1)肝窦狭窄：正常的肝窦间隙被肿胀的肝细胞所填塞，该病变≤1/2肝小叶者视为较轻(+)，大于1/2肝小叶者视为较重(++)。(2)肝窦阻塞：凡肝窦内见有形物质(红细胞、炎细胞、淡红染均匀物质)阻塞者，其轻重判断同(1)。(3)肝窦扩张：横径大于等于1倍正常肝窦横径者为较轻(+)，大于1倍以上者为较重(++)。(4)肝窦毛细血管化：肝窦扩张并构成毛细血管样腔隙且a-SMA染色阳性者，限于灶性坏死周边或小叶内单一表现型为较轻(+)，众多表现型或单一表现型但有环绕肝细胞团倾向为较重(++)。若伴内皮细胞固缩或纤维断裂则称损伤。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件处理数据，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察发现CHB轻者无肝窦扩张和毛细血管化，CHB患者肝组织病变程度与肝窦病变的关系见表1。表1资料显示肝组织病变程度与肝窦病变呈正相关，肝组织炎症病变重，其肝窦病变亦重,这与徐长江等研究结果相同[5]，且差异有统计学意义(P<0.01)。CD8，CD28分子表达与CHB肝窦病变的关系见表2～表5。提示肝窦狭窄、阻塞、扩张、毛细血管化重度其T淋巴细胞CD8，CD28分子表达最高，其差异有统计学意义(P<0.01)。肝窦和窦周隙是HBV病毒侵入肝实质时首先侵入的部位，并在该部位引发免疫反应，即T淋巴细胞攻击侵入的病毒，在保护机体的同时，如果免疫功能过强会对肝组织造成一定的病理性损伤。本研究提示在肝组织病变初期，肝窦狭窄、阻塞、扩张较轻时以细胞毒性(杀伤性)T淋巴细胞CD8+,CD28+分子的表达占优势；调节性T淋巴细胞CD8+，CD28-分子少表达。但与正常对照组相比均增高(表2-表4)。随着肝组织炎症病变加重，炎症坏死区T淋巴细胞CD8+，CD28+分子的表达增强(如图1)。而当肝组织肝窦毛细血管化较重，坏死修复并形成纤维间隔带或纤维瘢痕时则以抑制性(调节性)T淋巴细胞CD8+，CD28-分子表达为主。即CD8阳性细胞分布范围扩大，CD28阴性或者只单个点状阳性表达(如图2)。本研究还提示CD8，CD28分子表达多分布在肝组织炎症坏死区的肝窦病变区域，且以细胞毒性T淋巴细胞CD8+，CD28+表达为主。随着肝组织变性坏死加重，T淋巴细胞CD8+，CD28+分子表达增强，范围扩大(如图3)。而在肝组织变性坏死修复中，特别是当纤维瘢痕形成时，CD8+，CD28-分子表达增强(如图4)。表明T淋巴细胞CD8，CD28分子参与CHB病理演变全过程。故CD8，CD28分子表达与肝窦的病变与破坏相继存在，其表达变化与正常对照组及无肝窦病变肝组织比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 不同肝组织病变与肝窦病变关系

表2 肝窦阻塞与T淋巴细胞CD8 CD28分子表达关系

图1 炎症坏死区T淋巴细胞CD8+，CD28+分子的表 图2 即CD8阳性细胞分布范围扩大

图3 坏死重CD8+，CD28+分子强表达 图4 肝组织纤维瘢痕形成CD8+，CD28-分子表达。

表3 肝窦狭窄与T淋巴细胞CD8 CD28分子表达关系

表4 肝窦扩张与T淋巴细胞CD8 CD28分子表达关系

表5 肝窦毛细血管化与T淋巴细胞CD8 CD28分子表达关系

3 讨论

乙型肝炎发病是嗜肝病毒(HBV)侵入，机体免疫系统(特别是细胞免疫)对抗病毒引起肝组织及全身损伤的一个过程，故机体免疫过强或者不足均会导致肝脏损伤。

根据CD28分子表达与否，CD8T细胞分为细胞毒性T细胞(CD8+,CD28+)和抑制性T细胞(CD8+,CD28-)，两者分别是淋巴细胞中重要的杀伤效应细胞和免疫调节调节细胞。CD8+,CD28+细胞的丢失和CD8+,CD28-的积聚是T细胞功能下降的标志。如何能使乙肝病毒的复制对肝组织的损害和机体的效应细胞的对抗之间维持一种稳态，既可以维持保护性免疫，又不会对肝组织造成严重性损伤，这是值得深刻研究的问题。之前学者通过检测乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞表达来反应机体的免疫状态和肝组织的损伤情况，但这在一定程度上存在局限性。笔者通过对肝组织直接检测，光镜观察不同病变肝组织与肝窦病变的关系，同时T淋巴细胞CD8,CD28分子双染色，比较肝组织T淋巴细胞的表达与肝血窦的病变之间的关系，从而了解T淋巴细胞表达与肝组织损伤之间存在的联系。

肝血窦是两肝板之间特殊的腔隙，是一种特殊的肝脏毛细血管。肝窦亦是乙肝病毒(HBV)经血液循环进入肝组织首先侵犯并复制的部位。本组资料提示肝窦狭窄、阻塞较轻时，其CD8+CD28+分子表达情况多散在分布，每高倍镜视野单个核细胞染色阳性在20个以内。随着肝血窦狭窄、阻塞、扩张病变加重时，则淋巴细胞(免疫性T淋巴细胞)反应越强，呈弥漫性或大片状分布。这与机体免疫力增强相对应。但同时肝组织损伤亦较重。但当肝窦损伤达到一定程度，肝窦毛细血管化较重，肝组织损伤修复并形成纤维间隔带或纤维瘢痕时，则免疫性T细胞(CD8+,CD28+)阳性表达，多呈点状分布，每高倍镜视野小于20个单个核细胞阳性。此时抑制性T淋巴细胞(CD8+,CD28-)表达增强，这与机体免疫力开始下降相对应。与之前学者研究结果基本一致[5-7]。调节抑制过强免疫，可能是机体处于免疫耐受的阶段，此时期肝脏血管破坏较重，药物无法通过肝血管循环到达肝脏病变部位，故采取肝内介入疗法可能是有效的方法。本研究还提示，嗜肝病毒(HBV)侵入机体，机体免疫系统通过调节HBV复制与宿主应答之间的平衡来限制过度的肝脏病理损伤。故检测肝组织中CD8,CD28分子的表达，观察肝组织中肝血窦的病变，对判断患者的免疫状态和肝组织的损伤程度大有助益。

乙型肝炎病毒复制和免疫系统对抗其侵害之间的平衡的破坏是引起机体损伤的一个重要原因。如何使两者之间维持着动态平衡，避免免疫反应过激、过强，造成大面积肝组织坏死，是亟待解决的问题。

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Relationship between expression of intrahepatic CD8 and CD28 in patients with chronic hepatitis B and hepatic sinusoids' pathological changes

CHENFu-liang,TUYuan-hang,XUChang-jiang,etal.

(TheNo. 123HospitalofthePLA,Bengbu,Anhui233015,China)

Objective：To observe the relationship between expression of intrahepatic CD8 and CD28 in patients with chronic hepatitis B(CHB) and hepatic sinusoids' pathological changes.Methods：60 CHB patients admitted to our hospital were selected,who underwent liver biopsy with ultrasound guidance.Immunohistochemical method was used to examine the expression of CD8 and CD28 in hepatic tissues.The relationship between expression of CD8 and CD28 and hepatic sinusoids' pathological changes was observed and analyzed.Results:The expression of CD8 and CD28 was closely related to the contriction, emphraxis, dillation and sinusoidal capillarization in hepatic sinus. The results suggested that the expression of CD8+, CD28+T cells predominated over CD8+, CD28-T(cytotoxic T lympocyte) at liver lesions' early stage. The worse of the liver lesion was, the higher the expression of CD8+, CD28+T cells in liver inflammation necrotic area became.When liver sinusoidal capillarization happened,necrosis repair,fibrous tissue septum and fibrous scar formation were mainly expressed as CD8+,CD28-inhibitory regulatory T cells. Logistic regression analysis indicated that CD8+,CD28+T cells' expression was highest when the contriction, emphraxis, dilation and sinusoidal capillarization in hepatic sinus was severe(P<0.01).The above showed that the expression of CD8+,CD28+T cells took part in hepatic sinus lesions' pathological changes.Conclusion:The expression of intrahepatic CD8+,CD28+T cells in patients with CHB played a key role in the pathological changes of hepatic sinusoids.

Hepatitis B, chronic; Hepatic tissues; CD8; CD28; Hepatic sinusoids

解放军第123医院 1.病理科；2.肝病中心，安徽 蚌埠 233015

陈付凉(1986-)，男，技师，大学。

10.14126/j.cnki.1008-7044.2017.01.005

R 512.62

A

1008-7044(2017)01-0013-04

2016-08-22)