低温乳酸菌系驯化及其在玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵中的接种效果

贾军 ，曹文悦 ，晏磊 ，高亚梅 ，王彦杰 ，曲永利 ，王伟东

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

低温乳酸菌系驯化及其在玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵中的接种效果

贾军1，曹文悦1，晏磊1，高亚梅1，王彦杰1，曲永利2，王伟东1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

为了构建一种在低温条件下使玉米秸秆与马铃薯渣混合饲料良好发酵的复合菌系，通过连续限制性培养的方法，在10℃条件下静止培养，以pH值作为指标，获得一组使玉米秸秆与马铃薯渣混合饲料发酵的低温复合菌系。结果表明，在接种后7 d，低温乳酸菌复合系的pH可以下降到4以下。通过高通量测序结果表明，低温乳酸菌复合系的细菌组成在属的水平上主要为乳杆菌属（lactobacillus，72.8%），Candidatus Solibacter，2.2%，嗜酸栖热菌属（Acidothermus，0.8%）。接种乳酸菌复合菌系处理的发酵物有强烈的芳香气味，发酵15 d后，在发酵液中检测到大量乳酸和甘油。说明接种低温乳酸菌复合菌系可以明显改善玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵饲料的品质。

低温；乳酸复合菌系；玉米秸秆；马铃薯渣；饲料

玉米秸秆是最丰富的农作物资源之一，中国玉米秸秆年产量约7亿t，占全国秸秆年产量56.6%[1]。世界第四大粮食作物是马铃薯，仅次于小麦、水稻和玉米[2]。据联合国粮农组织统计，我国的马铃薯种植面积超过530多万hm2，年产量已突破8 000万t，马铃薯种植面积和总产量均跃居世界前列[3]。我国每年资源化利用的秸秆量约1.82 t[4]。秸秆焚烧造成严重的环境污染和巨大的资源浪费。同时，加工1 t马铃薯会产生9 t马铃薯淀粉渣，2010年我国马铃薯加工产业消耗马铃薯300万t，生产淀粉产生的马铃薯淀粉渣约为2 700万t[5-6]，基本没有无害化处理而丢弃，造成严重的环境污染。因此，开发出能够把秸秆和马铃薯渣资源化利用的技术，对于治理环境污染，促进相关产业发展意义重大。利用马铃薯渣和玉米秸秆混合发酵生产动物饲料，是可行的技术途径之一。

在我国北方，玉米收获、马铃薯收获和加工都是在9月以后，此时环境平均温度已经下降到10℃以下。在北方玉米秸秆和马铃薯渣混合发酵生产饲料的主要限制因素有：收获后的玉米秸秆与马铃薯渣的储运问题，发酵温度低的问题[7]，发酵方式和发酵配方合理性问题等。一些研究者就上述问题开展过相关研究，如，惠文森[8]在室温条件下用酵母菌对玉米秸秆成功的进行发酵试验，发现在一定程度上提高粗蛋白和粗脂肪的含量。王彦杰[9]通过连续限制性培养的方法在低温下获得了低温乳酸菌复合菌系，接种于干秸秆中可促进低温微贮进程，提高饲料品质。李娟[10]以马铃薯渣和玉米秸秆为主要原料，多菌种混合固态发酵生产蛋白饲料，显著提高了发酵物中的粗蛋白质和纯蛋白质含量。但是，针对于收获后玉米秸秆和马铃薯渣混合发酵用低温发酵菌剂及其应用效果的研究鲜有报道。

试验以玉米秸秆和马铃薯渣为主要处理对象，筛选富集了一组10℃低温乳酸菌复合系，分析了菌系的微生物多样性，并研究了接种低温乳酸菌复合菌系对于玉米秸秆和马铃薯渣混合发酵的影响。以期为寒区秸秆和马铃薯渣等农业废弃物的资源化利用行的技术途径和技术支持。

1 材料与方法

1.1 低温乳酸菌复合菌系的驯化

试验样品采自黑龙江省克山农场的奶牛小区的玉米青贮窖，从新鲜的青贮料中取样200 g，用无菌封口袋保存，现场取样后放在4℃冷藏待用。

乳酸菌的限制性培养采用MRS培养基（蛋白胨10 g，牛肉膏 10 g，酵母提取物 5 g，K2HPO42 g，柠檬酸氢二铵 2 g，乙酸钠 5 g，葡萄糖 20 g，吐温 801 mL，Mg－SO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸馏水1 L），调节pH为6.2，121℃灭菌20 min，冷却后4℃保存待用。

取45 mL MRS培养基装入50 mL螺口离心管中，加入2 g玉米秸秆青贮原料，作为原代，10℃静置培养。培养24 h后，按1%（体积分数比）的接种量，接入已灭菌的装有50 mL培养基的螺口试管中，在10℃条件下静置培养，连续培养7 d，每天定时检测培养液的pH值变化，连续继代培养20代，获得pH值下降基本稳定和菌种组成稳定的培养物。

1.2 低温乳酸菌复合系指标检测

1.2.1 低温乳酸菌复合系pH的测定

在培养的当天，第 1、2、3、4、5 d 时，用移液器在无菌操作台内取样200 μL，用HORIBA-212型酸度计测定培养液的pH。

1.2.2 低温乳酸菌复合系微生物量的测定

在培养的当天，1、2、3、4、5 d 时，取培养液于 2 mL离心管中，12 000 rpm离心10 min，弃上清，在波长为600 nm条件下测定吸光值，以不接菌的MRS培养基作为对照，测定复合菌系在生长过程中的微生物量。

1.2.3 低温乳酸菌复合系有机酸和醇含量测定

在复合菌系发酵的第5 d取发酵液2 mL，经12 000 rpm离心10 min后，取上清用0.45 μm的滤膜过滤，用高效液相色方法测定乳酸，乙酸，丙酸，甘油等成分含量。色谱条件：色谱柱：美国安捷伦1 200（300 mm×7.8 mm，5 μm），氢型色谱柱，流动相：2.5 mmol·L-1硫酸水溶液，流动相比例始终不变，流速：0.55 mL·min-1，柱温：室温，检测波长：210 nm，检测器为示差折光检测器。

1.2.4 低温乳酸菌复合菌系组成多样性分析

复合系在MRS培养基中培养24 h时，取6 mL发酵液12 000 rpm离心10 min，弃上清，用氯化苄法提取其总DNA[11]。

提取样品总DNA后，根据细菌V3+V4区设计得到引物，合并引物接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina MiSeq PE300进行测序。对序列进行聚类，将97%相似性的序列聚类成为 OTUs（Operational Taxonomic Units）。按众数原则对序列进行注释，对序列进行物种注释，统计每个样品中在属和种分类水平上的菌群做聚类，用相同颜色表示该属类所含的OTU序列丰度的相对高低。

1.3 低温乳酸菌复合菌系的接种效果及指标测定

1.3.1 发酵产物pH的测定

将玉米秸秆和马铃薯渣粉碎，玉米秸秆过65目筛。按照玉米秸秆与马铃薯渣重量比为3∶1的比例添加，并且添加麸皮1%，玉米面1%，尿素2%，将低温乳酸菌复合系均匀喷洒在发酵物表面，接种量为1%，含水率调节为70%，装于100 mL螺口瓶压实，用封口膜封口。10℃条件下发酵。以等量灭菌的MRS培养基处理作对照，每个处理重复三次，设置6次处理，在发酵的当天，2、5、7、10、15 d 时进行 pH 分析测定[12]。

1.3.2 发酵产物干物质、ADF和NDF的测定

称取发酵15 d后样品，105℃烘干8 h后，测定干物质含量，后粉碎，过40目筛，称取粉碎后样品1 g，利用纤维素分析仪测定酸性洗涤纤维ADF和中性洗涤纤维NDF[13]。

1.3.3 发酵产物有机酸和醇含量测定

取发酵15 d后的发酵液2 mL，经12 000 rpm离心10 min后，取上清用0.45 μm的滤膜过滤，用高效液相色方法测定乳酸，乙酸，丙酸，甘油等成分含量。色谱条件：色谱柱：美国安捷伦1 200（300 mm×7.8 mm，5 μm），氢型色谱柱，流动相：2.5 mmol·L 硫酸水溶液，流动相比例始终不变，流速：0.55 mL·min-1，柱温：室温，检测波长：210 nm，检测器为示差折光检测器[14]。

2 结果

2.1 低温乳酸菌复合菌系的驯化及指标

2.1.1 低温乳酸菌复合系的驯化

将青贮原料接种到MRS培养液，进行连续继代培养获得了一组功能和组成稳定的复合系。筛选过程中，第2、4、6、8和10代菌群发酵液的pH值如表1所示。在10℃条件下培养，培养到第3 d时，pH可迅速下降到4.2左右，之后pH下降缓慢，直到发酵的第5 d，pH稳定在3.6左右，各代pH变化趋势相差不大。从pH指标衡量，复合菌系性质已经稳定。

2.1.2 低温乳酸菌复合菌系生长曲线

取第20代的低温乳酸菌复合系进行微生物量的测定，从接种后的第0 d开始，每天定时取样，测定其在600 nm下的吸光值，以监测其生长过程中微生物量的变化，结果，如图1所示。由中可以看出，从整体上来说，微生物量随着培养的进行而不断增大。在培养的前3 d里，微生物量直线上升，由接种初期的0.582增加到3.498，从第4 d开始，微生物量增加缓慢，到第7 d时，微生物量趋于稳定，稳定在3.433~3.498之间。

表1 复合菌系在MRS培养基中发酵过程中的pH变化Table 1 Change of pH of bacterial community in MRS culture medium during fermentation

图1 复合菌系在MRS培养基中生长过程中微生物量的变化Fig.1 Dynamic trends of OD value of bacterial community in MRS culture medium

2.1.3 低温乳酸菌复合菌系发酵过程中的产物分析

利用高效液相色谱法测定培养液中有机酸等含量成分，其乳酸、乙酸、乙醇含量分别为1.19 g·L-1，0.3 g·L-1，0.15 g·L-1，未检测到丁酸（图 2）。可见在复合菌系培养5 d时，复合菌系培养液中含量最多的有机酸为乳酸。这表明此复合系可以接种于玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵饲料中，并且有利于提高混合发酵饲料的品质。

图2 复合菌系发酵产物含量Fig.2 The organic acids concentration in the products of composite bacterial community

2.1.4 低温乳酸菌复合菌系组成多样性分析

采用细菌16SrDNA高通量测序技术一共得到优化序列78 937条，平均长度462 bp，GC（%）含量为54.2%（表2），测序深度超过99.9%，理论上测序数据已经覆盖了样本中的全部序列。对序列随机抽样，统计抽样样本的序列数及其OUT数目，绘制稀释性曲线（图3）。可以看到曲线已经近平台期，说明更大的测序量不会引起OUT数目的显著增加，基于现有的数据量分析结果是准确可靠的。

表2 样品测序数据处理结果统计Table 2 Sample sequence data processing and statistics

图3 样品稀释曲线Fig.3 Dilution curve of samples

按相似度97%进行聚类分析，一共获得1 148个OUTs（表3），对样本的OUT多样性进行分析，发现Simpson指数为 0.295 307，Shannon指数为2.860 409。对序列进行随机抽样，统计抽样样本的序列数和shannon指数，发现曲线已经到达平台期（图4），说明更多的测序量已经不会引起物种多样性的增加，基于现有的数据量分析结果准确可靠。

表3 细菌组成丰度和多样性指数Table 3 Richness and diversity index of bacterial community

图4 多样性指数Fig.4 Relationship between Shannon-Wiener index

以OUT的物种分类结果为依据，分别在属和种两个分类级别上对样本中细菌的种类和相对丰度进行分析。在属的分类水平上分析可见，复合系主要由乳杆菌属（lactobacillus，72.8%），Candidatus Solibacter，2.2%，嗜酸栖热菌属（Acidothermus，0.8%），芽孢杆菌属（Bacillus，0.7%）构成，进一步在种水平上分析可知，复合系主要由副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，52.4%），乳酸肠球菌（Enterococcus faecium，0.6%），食烷菌（Alcanivorax dieselolei，0.5%）组成（图 5）。

图5 物种的种属分布图Fig.5 Distribution of genera

2.2 低温乳酸菌复合菌系的接种效果

2.2.1 发酵产物pH的测定

利用复合系对重量比为3∶1的玉米秸秆马铃薯渣混合饲料进行发酵，发酵过程中发现，随着培养时间的延长，接种复合菌的发酵物从第2 d开始有微芳香味，之后芳香味越来越浓，到第7 d味道达到最大。pH变化情况如表4所示，可知接种复合系的第2 d，pH从6.6迅速降到5，而对照组pH从6.6降到5.7。接种复合系的发酵物质的pH第5 d就可以降到4.1左右，而对照组的pH第5 d才降到4.5。由此可以判断，接种复合系不仅促进了pH的快速降低，创造了酸性环境，还可以抑制有害微生物的增长。

表4 接种复合菌系的玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵过程pH的变化Table 4 Change of pH during mixed fermentation of corn stalk and potato residue after inoculated treatments

2.2.2 发酵产物干物质、ADF和NDF的测定

由图6结果可见，将接种复合系处理的混合发酵饲料和不接菌处理的混合发酵饲料的干物质进行了比较。二者的干物质变化整体趋势相同，均为先升高后降低。接种复合系的混合发酵饲料和不接菌混合发酵饲料的干物质发酵15 d后，分别达到了47%和48.3%。接种复合系处理的试验组与不接菌处理的对照组相比干物质减少了1.3%，差异不显著。

图6 接种复合系干物质含量的变化Fig.6 Dry matter change of composite bacterial community after inoculated treatments

由图7图8可知，接种复合系处理的混合发酵饲料和不接菌处理的混合发酵饲料的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维均成下降趋势。发酵15 d后，接种复合系处理组的酸性洗涤纤维可降低到40.5%，而不接复合系处理的对照组的酸性洗涤纤维只减少到49.2%。接种复合系处理组的中性洗涤纤维可降低到71.4%，而不接复合系处理的对照组的中性洗涤纤维只减少到73.1%。结果表明，在马铃薯渣与玉米秸秆混合发酵饲料中接种此复合菌系可以降低中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维含量，与对照组相比差异显著。

2.2.3 发酵产物有机酸和醇的测定

使用高效液相方法检测接种低温乳酸菌复合系的玉米秸秆和马铃薯渣混合发酵饲料的发酵液有机酸含量（图9），使用峰面积外标法对产物进行定量分析，与对照组相比，接种处理的乳酸和乙醇含量都要高于对照组，接种处理组的乳酸含量达到1.11 g·L-1，而对照组的乳酸含量只有0.57 g·L-1。接种处理组在发酵的第15 d甘油含量为0.11 g·L-1，而对照组没有检测到甘油（表5）。说明此复合可以促进发酵过程并且产生大量乳酸和甘油，有利于提高玉米秸秆与马铃薯渣混合发酵饲料的品质。

图7 接种复合系酸性洗涤纤维含量的变化Fig.7 ADF change of composite bacterial community after inoculated treatments

图8 接种复合系对中性洗涤纤维含量的变化Fig.8 NDF change of composite bacterial community after inoculated treatments

图9 接种发酵15 d后发酵液有机酸含量Fig.9 The organic acid in inoculation of composite bacterial community after 15 days

表5 接种复合系发酵15 d后有机酸含量（g·L-1）Table 5 The organic acid in inoculation after 15 days

3 讨论与结论

关于利用微生物来发酵处理粗饲料到目前已经有很多报道，大多是依靠一种菌或者两种菌的简单组合来完成。研究表明，在饲料发酵中，利用复合系发酵的饲料产乳酸量要高于单一菌种或几种菌的人工组合，并且接种复合系发酵效的饲料营养价值要优于单一菌种或几种菌的人工组合[15-16]。利用复合系为饲料的接菌剂已经成为饲料业发展的必然趋势。

目前，由于研究目的和应用技术的不同，对利用乳酸菌复合系发酵的研究领域和深度也有不同的观点。大多数的研究主要是几种在常温乳酸菌复合菌系的研究，高丽娟[16]等将筛选的常温乳酸菌复合系接种于水稻、玉米、小麦秸秆，发现接种复合系的秸秆发酵产物中乳酸含量非常高，为18.53 g·kg-1，并检测到可以提高饲料风味的甘油、乙醇等物质。赖玉娇[17]等以紫花苜蓿为原料，添加不同乳酸菌剂，在常温条件下发酵发现，乳酸菌剂能在一定程度上通过保护真蛋白含量和提高快速降解碳水化合物组分及非结构性碳水化合物含量，从而提高苜蓿青贮营养价值。综合所述，发酵通常在常温下进行，对于在低温下向秸秆中接种微生物菌剂进行发酵的研究较少。

针对东北寒区秋季秸秆与马铃薯收获后，环境温度低的特点，试验以玉米秸秆青贮饲料中的自然菌为基础，通过长期限制培养和定向驯化，筛选到一组能在10℃条件下快速生长，使pH快速降低的低温乳酸菌复合菌系，复合菌系培养液中检测到乳酸、乙酸和甘油，其中以乳酸含量最为丰富。此复合菌系可在低温条件下使玉米秸秆与马铃薯渣的混合发酵饲料的pH值快速下降，随着发酵时间的进行，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量也明显降低。通过高效液相结果可看出，接种复合菌系的发酵产物中乳酸含量比对照组多，并且检测到甘油，而对照组没有。结果表明接种此低温复合系可以改善饲料风味并且提高饲料的适口性和风味，有效降低玉米秸秆与马铃薯淀粉渣混合饲料的pH值，抑制腐败菌的繁殖，提高秸秆饲料的营养价值。因此，低温复合系在东北寒区的饲料业具有很好的应用潜力和发展前景。

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Domestication of Lactic Acid Bacterial Community at Low Temperature and the Effect of Inoculation on Mixed Fermentation Fodder with Corn Stalks and Potato Residues

Jia Jun1，Cao Wenyue1，Yan Lei1，Gao Yamei1，Wang Yanjie1，Qu Yongli2，Wang Weidong1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

In order to get a composite microbial system used for fermenting mixing stalks of corn and potato residue to produce feeds at low temperature，the limited cultivation method and stable cultivating were carried out at 10 ℃ and pH value was used as the indicator of fermentation effect.The results showed that a composite microbial system capable of high lactic acid production was screened.After first 7 days of inoculation，the pH of microbial composite system could drops below 4.The results of high-throughput sequencing showed that mainly microbial in the genus classification levels was lactobacillus 72.8%，Candidatus Solibacter 2.2%and Acidothermus 0.8%.After 15 days of inoculation，the strong fragrant smell was emitted from feed of inoculated treatment.At the same time，a large number of lactic acid and glycerol were detected in the inoculated treatment.Therefore，the feed quality of mixed fermentation with corn stalk and potato residues could be improved by inoculation of the bacteria community.

low temperature；lactic acid bacteria community；corn stalk；potato residues；fodder

Q89

A

1002-2090（2017）06-0033-07

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.06.009

2016-09-12

“十二五”国家科技攻关计划项目（2012BAD12B05-3）；黑龙江农垦总局科技攻关项目（HNK125B-11-11A，HNK135-04-08）。

贾军（1991-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2014级硕士研究生。

王伟东，男，教授，博士研究生导师，E-mail：wwdcyy@126.com。