紫外线诱变白灵菇K5担孢子研究

陈 珣，杨 镇，肇 莹，肖 军，贺黎黎，张春凤

（1.辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳 110161； 2.凤城市大业食用菌有限责任公司，辽宁 凤城118100）

紫外线诱变白灵菇K5担孢子研究

陈 珣1，杨 镇1，肇 莹1，肖 军1，贺黎黎2，张春凤2

（1.辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳 110161； 2.凤城市大业食用菌有限责任公司，辽宁 凤城118100）

采用紫外照射法对白灵菇K5的担孢子进行诱变处理。结果表明：在紫外灯功率为15 W，照射距离为20 cm，诱变时间为7 min条件下，白灵菇K5致死率可达到74.29%。同时，通过初筛获得白灵菇K5生长状况良好的单孢菌株5株，确定其为下一步白灵菇诱变育种工作菌株。

白灵菇；担孢子；紫外线诱变；致死率；初筛

白灵菇（Pleurotus nebrodensis）又名白阿魏蘑、阿魏蘑菇，学名白灵侧耳，由于其形似灵芝而得名。白灵菇分类上属于担子菌门、侧耳科、侧耳属［1］。白灵菇的子实体营养非常丰富，菌肉肥美，香味浓郁，口感嫩滑，食药用价值较高，很受消费者欢迎，被誉为“草原上的牛肝菌”［2］。

目前，我国食用菌育种工作中，白灵菇育种工作相比其它食用菌较晚一些。传统的食用菌育种方法主要包括人工驯化育种、孢子分离育种、诱变育种、原生质体融合育种、杂交育种。诱变育种主要是利用物理或化学的方法来处理细胞群体，促使其少数细胞的遗传物质的分子结构发生变化，引起其遗传变异发生，从而选出少数具有优良性状的菌株。诱变育种所运用的理化因子称为诱变剂。由于诱变育种能有效地提高突变的频率，因此在食用菌新品种选育上应用甚广，而其中一种重要的诱变剂就是紫外线。紫外线辐射属于非电离辐射诱变剂，使用简便，但效果十分显著，是诱变产生突变种的重要途径。本实验通过对白灵菇品种K5担孢子紫外线耐受性研究和诱变单孢菌株的初筛，旨在为白灵菇紫外线诱变育种的进一步工作打下基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试品种

白灵菇品种K5为本课题组自主选育品种，其特点：低温、短柄。

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水 1 000 ml。

1.1.3 仪器设备

超净工作台，恒温培养箱，电子显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子采集

种菇选定后消毒，剪去种菇菌柄的2／3，75%的酒精表面消毒，无菌水冲洗数次，最后用无菌纱布吸干菇体表面水分。将消过毒的种菇插入孢子采集支架上，支架下放有滤纸，外面用烧杯套住。

1.2.2 紫外线诱变与致死率计算

在无菌条件下，用接种针挑取一定量的孢子，注入10 ml无菌水中摇匀，再从中取出1 ml孢子液，加入9 ml无菌水中。如此反复稀释，一直到稀释液中大概有106个／m l。取少量孢子悬浮液，约0.1 ml，置于9 cm培养皿中，用玻璃棒在琼脂平板上均匀涂布。置距离紫外灯20 cm处进行紫外照射，分别照射1～15 min，每个处理重复3次。以同样的操作，将未经紫外线处理的孢子稀释液涂平板作为对照。从紫外线照射处理开始，直到涂布完平板的每个操作步骤都需在红灯下进行。

将涂匀的平板，用黑布包好，置于25℃培养箱中培养3 d，将培养好的平板取出进行菌落计数，根据对照平板和处理平板上的菌落数，计算致死率［3］。

致死率（%）＝100-（处理后每0.1 ml菌落数／对照每0.1 ml菌落数）×100

1.2.3 诱变单孢菌株初筛

选取致死率在70%～80%之间的照射平板，用黑布包好，在25℃条件下黑暗培养，培养期间每天取出镜检。当清楚看出单个孢子及萌发出的芽管时，将确定只有一个孢子萌发的琼脂块直接移到固体斜面培养基上，置于适温条件下培养。以菌落形态大小为指标进行初筛，挑取生长快、菌丝强壮、边缘整齐、镜检菌体较一致的单孢菌株。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变、致死率分析

由表1可见，处理时间在2 min内，致死率比较低，说明短时间内的紫外线处理，对该孢子的生长影响并不大；以后随着时间的增加，致死率稳步上升，当处理时间增至7 min时，致死率有了明显的增加，致死率达到74.29%；当处理时间为14 min时，致死率已达到100%，故初步断定该孢子对紫外线的最长耐受时间为14 min。

紫外线诱变现在倾向于采用致死率70%～80%，认为该条件下的人工诱变可以提高突变频率，能够创造自然界原来没有的性状。本实验紫外线诱变处理7 min时，致死率达74.29%，因此，本实验选择紫外线诱变7 min作为致死时间。

2.2 诱变单孢菌株初筛

选取紫外诱变时间为7 min的白灵菇K5担孢子的照射平板，显微镜下挑取单孢50株，固体斜面培养基培养。以菌落形态大小为指标进行诱变菌株初筛，筛选获得5个生长快、菌丝浓密、边缘整齐、镜检菌体较一致的单孢菌落，分别命名为：K5-1号、K5-2号、K5-3号、K5-4号、K5-5号。

从图1可见，相同培养条件下，筛选菌株与淘汰菌株相比，生长速度快、菌丝浓密、表现出了较强的生长活力。

表1 白灵菇K 5不同处理时间的菌落数与致死率Table 1 The colony count and fatality rate of K 5 at different p rocessing time

图1 白灵菇K 5诱变单孢菌株优劣对比Figure 1 Com parison of the advantages and disadvantages of among the K5 mutagenesis strains

3 结论与讨论

现代育种理论认为，被诱变的微生物致死率在70%～80%时，产量性状的正突变率较高［4］。本试验对白灵菇品种K5担孢子进行紫外线诱变，当处理时间为 3 min时，致死率就已达到41.90%，说明白灵菇孢子对紫外线较为敏感。处理时间为7 min时，致死率已达到74.29%。因此，选取7 min诱变的白灵菇担孢子进行初筛，获得5株生长速度快，菌丝强壮的单孢菌株，暂定其为今后白灵菇紫外线诱变育种研究的出发菌株。

日常生产过程中，食用菌作为一种大型真菌，会以一定的频率发生自发突变。但自发突变的几率很低，一般只在10-6～10-9间，变异程度也较轻微，所以育种成功率相对较低。而诱变育种则可以大大提高育种的成功率，诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的细胞群，促进其突变率显著提高，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变菌株，作为生产和研究之用。紫外线来源方便，实际效果优良，故本试验将其作为诱变方法。

我国食用菌育种中，白灵菇育种相对较晚，品种种类不够丰富，有的品种在生产上有一定的难度，所以要加快选育生产性状好、适宜商品化栽培的优良白灵菇新品种的步伐，才能更好的适应现代社会的需求。本试验选用的白灵菇K5品种为辽宁省主栽品种，具有低温、短柄的特点，为打破该品种子实体低温生长的制约，使白灵菇品种农艺性状得到改良，本试验采用紫外线这一诱变剂完成了对白灵菇K5诱变单孢菌株的初筛，为进一步的诱变育种工作奠定了基础。

［1］ 王振和，王斌，武忠伟，等.31个白灵菇菌株的培养特性及亲缘关系初探［J］.食用菌，2007（3）：20～22.

［2］ 陈忠纯，林汝楷.侧耳属种间有性杂交研究［J］.食用菌学报，1998，5（2）：8～12.

［3］ 刘曲滨，肖方正，陈子健，等.铬酵母中铬含量的测定［J］.饲料工业，2000，21（6）：34～35.

［4］ 周德庆.微生物学教程［M］.高等教育出版社，1993：249.

The Study of Basidiospore of Pleurotus nebrodesis K5 with UV Mutagenesis

CHEN Xun1，YANG Zhen1，ZHAO Ying1，XIAO Jun1，HE Li-li2，ZHANG Chun-feng2（1．Institute of Edible Fungi Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang，Liaoning 110161； 2．Fengcheng Daye Edible Fungus Limited Liability Company，Fengcheng，Liaoning 118100）

s：The basidiospores of K5 wasmutagenized by ultraviolet radiology.The results showed that：The fatality rate of K5 was74.29%when irradiated for 7min with 15W ultraviolet lamp 20 cm away from it.At the same time，five strains of single spore strain of K5 were obtained.And these strainswere determined as the original strains used for ultravioletmutagenesis breeding during next step.

Pleurotus nebrodensis；Basidiospore；UV mutagenesis；Fatality rate；Primary screen

Q813.5

B

1002-1728（2017）06-0082-03

10.3969／j.issn.1002-1728.2017.06.020

2017-12-15

陈珣（1979-），女，硕士，助理研究员，主要从事食用菌遗传育种和栽培研究。E-mail：chenxun＿82＿ren＠126.com通讯作者：肖军（1974-），女，硕士，研究员，主要从事食用菌遗传育种和栽培研究。E-mail：xiaojun20002＠163com