紫色红曲霉FBKL3.0018液态发酵产红曲色素条件的优化研究

王 艳，邱树毅，王 啸，胡 娜，唐佳代，吴鑫⒈*

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

紫色红曲霉FBKL3.0018液态发酵产红曲色素条件的优化研究

王 艳1，2，邱树毅1，2，王 啸1，2，胡 娜1，2，唐佳代1，2，吴鑫⒈1，2*

（1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

以分离自贵州某浓香型酒厂中温大曲的紫色红曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018为研究对象，以发酵液中红曲色素色价为考察指标，对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的发酵培养基配方进行优化。考察了碳源、氮源、无机盐、生长因子及初始pH值对红曲色素生产的影响，选取对红曲色素生产影响较显著的蛋白胨、FeSO4和初始pH进行响应面优化试验。得到最佳培养基配方为：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5。在此优化条件下，红曲色素色价为105.22 U/mL，比优化之前（33.62 U/mL）提高了3.13倍。同时，通过验证试验，实际值105.22 U/mL与预测值108.82 U/mL相对误差为0.97%，说明所建立的回归模型可靠。

紫色红曲霉；红曲色素；液态发酵；响应面法；优化

红曲色素是红曲霉代谢过程中形成的一系列聚酮类混合物[1]，由黄色素、桔黄色素和红色素组成，是微生物生产的纯天然色素，主要成分有红曲素、红曲黄素、红斑胺、红曲红胺、红斑素及红曲红素[2]。红曲色素具有抑菌和增强免疫力[3]的功效，已成为医药卫生[4-5]、防腐保健和食品着色[6-10]、纺织[11-16]等领Ⅱ研究开发的热点。

红曲色素可通过固态或液态发酵的方法获得，但传统固态发酵产红曲色素的方法因生产过程繁杂、得率较低、生产周期长等缺点满足不了市场需要，严重制约了红曲色素的工业化生产及应用[17]。而液态发酵产红曲色素具有生产安全、稳定、生产周期短等特点，但红曲色素色价偏低。有学者通过研究红曲霉菌的发酵工艺[18-20]、发酵条件[21-23]和培养基成分[24-25]来促进红曲色素产量增加。

紫色红曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018分离自贵州某浓香型酒厂中温大曲[26]，其来源安全，实用价值高。本试验通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计和响应面分析对其红曲色素研究，通过考察发酵培养基组分、生长因子以及初始pH对其产红曲色素的影响，以期为提高该菌在白酒生产及其他方面的实用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫色红曲霉（Monascus purpureus）FBKL3.0018：筛选自贵州某浓香型酒厂中温大曲。

磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、无水氯化钙（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨：上海博微生物科技有限公司；L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu）（纯度≥99%）：上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99%；无水乙醇：天津市富于精细化工有限公司；FeSO4：成都金山化学试剂有限公司；B族维生素：北京奥博星生物技术有限责任公司。

斜面培养基采用麦芽汁琼脂培养基（malt extract agar，MEA）；种子培养基：麦芽糖40g/L，NaNO32g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO42g/L，pH自然，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20 min；基础发酵培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH自然，用蒸馏水配制，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

ThermoFisher台式高速冷冻离心机：美国ThermoFisher公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；723型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司制造；PHS-3CpH计：上海鸿盖仪器有限公司；HH数显恒温水浴锅：江苏金坛市中大仪器厂；ZQPL-200振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养方法

（1）菌种活化

将转接好的菌种斜面放置于30℃恒温培养箱，斜面培养基，培养活化5～7 d。

（2）种子培养

将活化好的菌种用接种环刮至装有玻璃珠的无菌生理盐水中，30℃，160 r/min，振荡1 h，经无菌脱脂棉过滤后镜检，制成1×107～108个/mL的孢子悬液。接种体积分数9%的接种量将孢子悬液至装液量为50 mL/250 mL种子培养液中30℃、160 r/min摇瓶培养18 h。

（3）发酵培养

接种体积分数9%的种子培养液至装液量为50 mL/250 mL基础发酵培养基中，30℃、160r/min摇瓶培养96h。

1.3.2 紫色红曲霉发酵培养产红曲色素的试验设计

（1）单因素试验设计

在基础发酵培养基基础上，通过改变碳源（乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖）及碳源质量浓度（20g/L、40g/L、60g/L、80 g/L、100 g/L）、氮源（氯化铵、硝酸钠、蛋白胨、全脂奶粉、脱脂奶粉）及氮源质量浓度（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、无机盐、生长因子、发酵液初始pH值，以红曲色素色价为考察指标，对发酵培养基组成进行单因素试验，每组试验重复3次，试验结果取其均值。

（2）Plackett-Burman试验设计

采用Design-Expert软件中N=12的Plackett-Burman试验设计，以红曲色素色价（Y，U/mL）响应值，对培养基中的碳源、氮源、无机盐、生长因子及初始pH进行筛选，每个因素设置+1和-1水平，为了避免遮掩其他因素的重要性，+1水平取-1水平的1.25倍进行试验，每组试验重复3次，试验结果取其均值。

（3）响应面分析法

根据Plackett-Burman试验设计结果，选取对红曲色素生产影响较显著的蛋白胨、FeSO4、初始pH 3个因素为自变量，以红曲色素色价（Y）为响应值，采用Box-Behnken进行中心组合设计，进行3因素3水平试验，每组试验重复3次，试验结果取其均值。

1.3.3 测定方法

色价测定：根据林元山等[27-28]的色价测定方法改进如下，取1 mL发酵液加入装有9 mL体积分数90%的乙醇水溶液的试管中，加塞、摇匀，静置18 min后，取上清液，用体积分数90%的乙醇水溶液稀释250倍数，体积分数90%乙醇水溶液作对照。采用可见光分光光度计，检测波长350 nm处黄色素吸光度值、470 nm处橙色素吸光度值和510 nm处红色素吸光度值。吸光度值乘稀释倍数即为发酵液色价，最后将3组色素色价叠加，即为胞外红曲色素色价。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源对产红曲色素的影响

以基础发酵培养作对照，考察不同碳源（添加量40g/L）对产红曲色素的影响，试验结果如图1所示，相同试验条件下，不同浓度的葡萄糖对红曲色素产量的影响如图2所示。

图1 不同碳源对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

由图1可知，葡萄糖作为单糖能更快被菌体利用，对红曲色素分泌影响最大，产物积累最多，红曲色素色价为41.5 U/mL；其次为蔗糖，红曲色素色价为37.5 U/mL；可溶性淀粉或乳糖作为碳源时红曲色素的色价较低，分别为20.5U/mL、15U/mL。

由图2可知，当葡萄糖含量为60 g/L时，红曲色素色价最高，为45.9 U/mL；其次为葡萄糖含量为40 g/L、80 g/L，红曲色素色价分别为41.6 U/mL、39.2 U/mL；葡萄糖含量为20g/L、100g/L时红曲色素的色价较低，分别为26.2 U/mL、27.1 U/mL。

图2 不同葡萄糖含量对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.2 Effects of different glucose contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.2 氮源对产红曲色素的影响

以基础发酵培养作对照，考察不同氮源（添加量2g/L）对红曲色素产量的影响，试验结果如图3所示。由图3可知，蛋白胨对红曲色素影响最大，红曲色素色价为59.25U/mL。

图3 不同氮源对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.3 Effects of different nitrogen source on pigment production by M.purpureusFBKL3.0018

相同试验条件下，不同浓度的蛋白胨对红曲色素产量的影响如图4所示。由图4可知，当蛋白胨含量为25 g/L时，红曲色素产量最高，红曲色素色价为65 U/mL。

图4 不同蛋白胨含量对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.4 Effects of different peptone contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.3 无机盐对产红曲色素的影响

以基础发酵培养作对照，考察不同无机盐（添加量2g/L）对红曲色素产量的影响，试验结果如图5所示。由图5可知，FeSO4对红曲色素的促进作用较为明显，红曲色素色价为74.25U/mL。

图5 不同无机盐对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.5 Effects of different mineral salts on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

相同试验条件下，不同浓度的FeSO4对红曲色素产量的影响如图6所示。由图6可知，1g/L的FeSO4对代谢物红曲色素分泌影响最大，红曲色素色价为93.75U/mL。

图6 不同FeSO4含量对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素产量的影响Fig.6 Effects of different FeSO4contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.4 生长因子对产红曲色素的影响

图7 不同生长因子对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.7 Effects of different growth factors on monascus pigment production byM.s purpureusFBKL3.0018

以基础发酵培养作对照，不同生长因子（添加量3g/L）对红曲色素产量影响结果如图7所示。由图7可知，L-谷氨酸对红曲色素的形成影响最大，红曲色素色价为41.5U/mL。

相同试验条件下，不同浓度的L-谷氨酸对红曲色素产量的影响结果如图8所示。由图8可知，L-谷氨酸含量为2g/L条件下，红曲色素色价最高为44.5 U/mL。

图8 不同L-谷氨酸含量对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.8 Effects of different L-Glu contents on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

2.1.5 初始pH对产红曲色素的影响

以基础发酵培养基作对照，不同初始pH对红曲色素产量影响结果，如图9所示。

图9 不同初始pH值对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的影响Fig.9 Effects of different pH values on monascus pigment production byM.purpureusFBKL3.0018

由图9可知，不同起始pH对红曲色素形成的差异较大。当发酵液初始pH 4.8时，红曲色素产量最大，红曲色素色价为48.1 U/mL。

2.2 培养基Plackett-Burman试验设计及结果

Plackett-Burman试验设计及结果见表1，各因素主效应分析见表2。

表1 Plackett-Burman试验设计及结果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

续表

表2 Plackett-Burman因素水平及主效应分析Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments and main effects analysis

由表2可知，在95%水平以上的影响因素有：蛋白胨、FeSO4、初始pH值。所以本研究选取这3个差异比较显著的因素进行下一阶段的响应面分析。

2.3 紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素响应面优化结果

（1）响应面优化结果及回归模型方差分析

在Plackett-Burman试验设计和主效应分析的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计进行3因素3水平试验，中心组合试验设计因素与水平见表3，试验设计及结果见表4。

表3 中心组合试验设计因素与水平Table 3 Factors and levels of central composite design

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

续表

表5 回归方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

对回归模型进行方差分析，由表5可知，P＜0.01，失拟项P＞F值＞0.05，说明回归模型极显著，失拟检验不显著，即该模型在所研究区Ⅱ内拟合性较好。

利用中心组合试验设计，用Design-Expert 8.06软件对试验结果进行多元回归分析，得到紫色红曲霉FBKL3.0018所产红曲色素对蛋白胨（X1）、FeSO4（X2）、初始pH（X3）的拟合回归方程为：Y=105.54-0.31X1-1.44X2+1X3+1.29X1X2-4X1X3+0.34X2X3-3.28X12-2.99X22-6.21X32。

针对拟合的回归方程进行误差统计分析，分析结果见表6。

表6 回归方程误差统计分析Table 6 Statistical analysis of regression equations

由表6可知，R2=0.979 3，R2Adj=0.952 8这两个值高且接近，表明回归模型足以解释生产红曲色素的培养基优化过程，能够解释97.93%试验所得红曲色素产量的变化，所以方程拟合较好；变异系数（coefficient of variation，CV）＜10%，说明试验可信度强及精确度较高。综上说明该回归方程给紫色红曲霉FBKL3.0018生产红曲色素提供了一个良好的模型。

（2）相应曲面和等高线图率

根据回归方程分别做出两两试验因素间交互作用三维立体响应曲面图和等高线如图10所示，它们分别反⒊了初始pH值、蛋白胨、FeSO4这3个因素间两两交互作用对响应值的影响。由回归方程知，二次项系数都为负值，表明所表征的抛物面向下，出现有极大值。采用Design-Expert8.06软件进行分析，得到形成红曲色素的最优培养基配方为蛋白胨26.2 g/L、FeSO40.9 g/L、初始pH 4.51。

图10 蛋白胨、初始pH和FeSO4交互作用对紫色红曲霉FBKL3．0018产红曲色素影响的响应曲面及等高线Fig．10 Response surface plots and contour line of effects of interaction of peptide，initial pH and FeSO4on monascus pigment production byM．purpureusFBKL3．0018

（3）回归模型验证试验

为了方便实际操作，修改培养基配方为蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、初始pH 4.5。验证响应面所建模型的预测值，用优化后的培养基进行3次重复试验，3次试验结果均值为105.22 U/mL，与预测值108.82 U/mL较接近，相对误差为0.97%。表明预测值与实际值具有较好的拟合性，优化模型切实可靠。同时，优化后的红曲色素色价（105.22 U/mL）是优化前（33.62 U/mL）的4.13倍，说明本试验设计的优化方案合理可行，得到的培养基能明显提高红曲色素的产量。

3 结论

在单因素试验基础上，采用Plackett-Burman试验设计，利用响应面对紫色红曲霉FBKL3.0018产红曲色素的发酵培养基配方进行优化，建立产红曲色素回归模型，经验证试验证明该模型切实可行。确定紫色红曲霉FBKL3.0018代谢产红曲色素的最佳培养基配方为：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5，在此条件下，红曲色素色价为105.22 U/mL，是优化前的4.13倍。

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Optimization of submerged fermentation conditions ofMonascus purpureusFBKL3.0018 for monascus pigment production

WANG Yan1,2,QIU Shuyi1,2,WANG Xiao1,2,HU Na1,2,TANG Jiadai1,2,WU Xinying1,2*
（1.Guizhou Key Lab of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China）

UsingMonascus purpureusFBKL3.0018 isolated from medium temperature Daqu of Guizhou Luzhou-flavor distillery as research object,the monascus pigment color value of fermentation broth as investigation index,the medium formula ofM.purpureusFBKL3.0018 fermentation for pigment production was optimized.The effects of carbon source,nitrogen source,inorganic salt,growth factors and initial pH on the production of monascus pigment were investigated,and the factors（peptone,FeSO4and initial pH）significantly affecting the pigment production were optimized by response surface methodology.Results showed that the optimal medium formula was glucose 60 g/L,peptone 26 g/L,FeSO40.9 g/L,L-Glu 2 g/L and initial pH 4.5.Under the optimized medium,the color value of the monascus pigment was 105.22 U/ml,which was 3.13 times that of before optimization （33.62 U/ml）.At the same time,through validation experiments,the relative error between the actual value （105.22 U/ml）and the predicted value （108.82 U/ml）was 0.97%,which indicated that the established regression model was reliable.

Monascus purpureus;monascus pigment;submerged fermentation;response surface methodology;optimization

TQ929.2

0254-5071（2017）12-0057-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.012

2017-10-09

贵州省科技计划项目黔科合LH字（【2014】7675）

王 艳（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物与发酵技术。

*通讯作者：吴鑫⒈（1975-），女，副教授，硕士，研究方向为酶工程。