河南省猪源沙门氏菌的分离鉴定与血清分型

过效民

（河南省畜牧总站，河南 郑州 450008）

河南省猪源沙门氏菌的分离鉴定与血清分型

过效民

（河南省畜牧总站，河南 郑州 450008）

为了了解河南省猪源沙门氏菌的血清型分布，从郑州、开封、焦作、许昌4个地市猪屠宰场抽取盲肠内容物840批，通过对细菌的分离培养、纯化，采用PCR和BD PhoenixTM-100全自动微生物鉴定系统对分离的沙门氏菌进行鉴定，应用玻片凝集试验进行血清型鉴定。共分离沙门氏菌67株，分离率为8.0%，其中德尔卑沙门氏菌32株、鼠伤寒沙门氏菌31株，表明河南省猪源沙门氏菌以德尔卑沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌为主。

沙门氏菌；分离；鉴定；血清分型

沙门氏菌是可导致人畜食物中毒和发病的重要病原菌，据统计，全世界各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒排在榜首[1]。人畜感染沙门氏菌后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它能加重病态或死亡率，也能降低动物的生产繁殖能力。沙门氏菌的血清型众多，目前已检出的血清型多达2 600种，我国约有300种血清型37个血清组，虽然世界各国流行的沙门氏菌有所差异，但主要血清型都包括肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等[2]。

该试验从河南省4个地市猪的屠宰场抽取盲肠内容物样品，进行沙门氏菌分离、鉴定，随后进行血清分型，以期掌握河南省猪源沙门氏菌血清型分布情况，为河南省畜禽养殖业防控因沙门氏菌引起的疾病以及维护公共卫生安全提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

2016年1月 至2016年12月抽取郑州、开封、焦作、许昌4个地区规模化猪屠宰场猪盲肠内容物样品840批，其中郑州220批，开封200批，焦作220批，许昌200批。

1.1.2 菌株

鼠伤寒沙门氏菌质控菌株ATCC14028（购自中国兽医药品监察所）。

1.1.3 培养基与试剂

灭菌50 ml离心管、革兰氏阴性细菌鉴定板，一次性无菌采样棒（BHI），沙门氏菌显色培养基，swarm半固体琼脂，营养琼脂，沙门氏菌诊断血清，一次性接种棒，PCR预混酶。

1.1.4 仪器设备

低温可叠放摇床，梯度PCR仪，凝胶成像系统。

1.1.5 引物

沙门氏菌invA基因引物P1：5’-GTGAAATTATCGCC ACGTTCGGG-3’，P2：5’-CATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’，扩增片段长度为284 bp。

1.2 试验方法

1.2.1 预增菌

将使用一次性无菌采样棒采集的猪盲肠内容物样品尽快送往实验室，36℃培养16～20 h，同时设阳性和阴性对照。

1.2.2 PCR初筛

采用菌液PCR，无菌吸取5 μl预增菌菌液为模板进行PCR扩增，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。

反应体系：Taq PCR Master Mix 25 μl，ddH2O 18 μl，P1、P2各1 μl，模板5 μl。

PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃后延伸5 min；4℃保存。同时设置阳性对照、阴性对照。

1.2.3 电泳

配制浓度为1.5%的琼脂糖溶液，于微波炉中加热溶解，待冷却至50～60℃时，加入溴化乙锭（使其终浓度达到0.5 μg/ml）混匀，倒入已插上梳子的胶槽内。待凝固后，转入电泳槽中，在每个泳道中加入8 μl的PCR产物，160 V，电泳15～20 min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像。

1.2.4 样品的分离、纯化及鉴定

取PCR初筛阳性菌液1～2环，划线于沙门氏菌显色培养基上，36℃培养20～24 h，选取单个典型菌落进行纯化，最后将纯化好的菌落划线接种于营养琼脂培养基，采用药敏试验进行鉴定。

1.2.5 血清分型

先测Ο抗原，用无菌枪头取营养琼脂上经鉴定的沙门氏菌与载玻片上加有10 μl沙门氏菌A-F群“Ο”多价诊断血清混匀，轻轻摇动玻片，于30 s内读取结果，凝集为阳性，浑浊或清亮为阴性，同时设无菌生理盐水为对照。测完“Ο”多价后再测“Ο”单价。

测完Ο抗原后测H抗原，先测Ⅰ项，用一次性接种棒将营养琼脂上沙门氏菌轻轻点接到swarm半固体琼脂中央上，注意不要刺破琼脂。用无菌枪头取swarm半固体琼脂上的菌落先进行HMA、HMB、HMC、HMD多价测定，然后进行单价测定；Ⅰ项测定完毕后，选出需要测Ⅱ项的，用一次性接种棒点接在加有相应诱导剂的swarm半固体琼脂上，然后按Ⅰ项方法进行Ⅱ项的测定。

2 结果

2.1 样品中沙门氏菌的分离鉴定结果

经预增菌培养、PCR初筛及样品的分离纯化，最后经药敏试验鉴定，共分离沙门氏菌67株，分离率为8.0%，具体结果见表1。

表1 河南省猪屠宰场沙门氏菌分离情况

2.2 沙门氏菌血清分型结果

分离的67株沙门氏菌共分为5个型，分别为Derby（德尔卑）、Typhimurium（鼠伤寒）、Give（吉韦）、Reading（里定）、Tumodi（图莫迪），其中德尔卑沙门氏菌32株，鼠伤寒沙门氏菌31株，吉韦沙门氏菌2株，里定沙门氏菌和图莫迪沙门氏菌均为1株，具体结果见表2。

表2 河南省猪源沙门氏菌血清型分布

3 讨论

近年来，沙门氏菌的污染在全世界范围内对食品安全问题产生了严重的影响。由沙门氏菌活菌导致的食物中毒属于感染型中毒，主要是由于活菌进入生物体肠道内通过淋巴系统进入血液引起全身感染，导致胃肠道的黏膜发炎引起腹泻、体温升高等症状[3]。在我国，由细菌污染导致的人食物中毒中70%以上是由沙门氏菌引起的，引起沙门氏菌中毒的食物中，畜产品占90%[4]。动物源性食品中重要的致病菌出现主要来自动物养殖期间的感染和屠宰加工过程中的污染两个方面。因此，对屠宰场沙门氏菌的检测及血清分型对公共卫生以及产业经济有着十分重要的意义。

通过对河南省屠宰场抽取猪盲肠内容物样品进行沙门氏菌分离鉴定，共分离沙门氏菌67株，分离率为8.0%，其中焦作、郑州、开封、许昌的分离率分别为12.7%（28/220）、9.1%（20/220）、6.5%（13/200）和 3.0%（6/200）。这一结果与狄文婷等[5]所研究的大连新鲜猪肉中沙门氏菌的分离率17.6%相比较低，与岳秀英等[6]所研究的四川养猪场猪肛拭子样品中沙门氏菌的分离率5.68%相比稍高，表明不同地区、不同采样部位中沙门氏菌分离率存在差异。

通过对67株沙门氏菌进行血清型鉴定，共有德尔卑沙门氏菌32株，鼠伤寒沙门氏菌31株，吉韦沙门氏菌2株，里定沙门氏菌和图莫迪沙门氏菌均为1株。其中郑州、开封、许昌均为德尔卑沙门氏菌最多，其次为鼠伤寒沙门氏菌；焦作鼠伤寒沙门氏菌最多，其次为德尔卑沙门氏菌。这一结果与陈玲等[7]人在对南方食品中沙门氏菌污染情况的调查一致。而与Wang[8]等在对安徽鸡屠宰场的调查发现中，印第安纳沙门氏菌和婴儿沙门氏菌是主要的两种血清型的结果不一致。表明因地域、环境和用药情况不同，不同样品来源、不同地区或同一地区不同时间沙门氏菌的流行优势菌株有所不同。

该试验结果表明，河南省不同地区的猪屠宰场沙门氏菌的污染情况存在差异，血清型种类也各异，这是由于各地区养殖环境、气候条件、用药情况及屠宰场的卫生情况不同所致。以后应进一步规范养殖场合理用药，改善屠宰场环境卫生，防止屠宰过程中沙门氏菌交叉污染，从动物性食品的源头控制沙门氏菌的污染，保证食品卫生安全。

[1]王士平.沙门氏菌食物中毒急救及防控措施[J].临床合理用药杂志，2012，5（8）：9-10.

[2]徐桂云，樊世杰.家禽沙门氏菌感染现状及不同国家的防治策略[J].中国家禽，2012，34（9）：7-12.

[3]王润蠢.环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌的研究[D].河北农业大学，2010.

[4]王娟，王君玮，曲志娜，等.畜禽产品中致病菌污染的危害、现状与对策[J].中国动物检疫，2013，30（12）：24-28.

[5]狄文婷，杜雄伟，吴静，等.猪源沙门氏菌的分离与耐药性分析[J].江苏农业科学，2014，42（10）：278-280.

[6]岳秀英，葛荣，汪开毓，等.四川省猪源沙门氏菌及耐药性变迁调查[J].四川动物，2015，（5）：707-713.

[7]陈玲，张菊梅，杨小鹃，等.南方食品中沙门氏菌污染调查及分型[J].微生物学报，2013，（12）：1326-1333.

[8]Wang H，Ye K，Wei X，et al.Occurrence，antimicrobial resistance and biofilm formation of Salmonella isolates from a chicken slaughter plant in China[J].Food Control，2013，33（2）：378-384.

S852.61

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1004-5090（2017）10-0006-02

2017-08-15）