温郁金挥发油通过PI3K/Akt信号途径对阿尔茨海默模型小鼠tau蛋白磷酸化表达的影响

齐越，秦文艳，康凯，姜鸿，李昭，王亚斌，贾冬

1.辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁中医药大学实验中心，辽宁 沈阳 110847

论著·实验研究

温郁金挥发油通过PI3K/Akt信号途径对阿尔茨海默模型小鼠tau蛋白磷酸化表达的影响

齐越1，秦文艳1，康凯2，姜鸿1，李昭2，王亚斌2，贾冬2

1.辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁中医药大学实验中心，辽宁 沈阳 110847

目的 观察温郁金挥发油对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠tau蛋白磷酸化的影响，探讨其相关作用机制。方法 60只昆明种小鼠随机分为假手术组、模型组、温郁金挥发油低剂量组、温郁金挥发油高剂量组、盐酸多奈哌齐组和参枝苓组，海马组织注射Aβ25-35制作AD小鼠模型，各给药组给予相应药物灌胃，连续15 d。末次给药后，免疫组化检测小鼠tau蛋白磷酸化位点（Ser 404和Thr 231）的蛋白表达，Western blot 检测tau蛋白磷酸化位点及磷脂酰肌醇-3-激酶信号/蛋白激酶B（PI3K/Akt）的蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组tau蛋白磷酸化位点蛋白表达增加（P＜0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，温郁金挥发油高剂量组tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明显降低（P＜0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。结论 温郁金挥发油可降低模型小鼠tau蛋白磷酸化水平，其作用机制可能与PI3K/Akt信号途径有关。

温郁金挥发油；阿尔茨海默病；tau蛋白；磷脂酰肌醇-3-激酶信号/蛋白激酶B；小鼠

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以进行性记忆力减退、行为异常和认知功能发生障碍为特征的慢性神经退行性疾病[1]，其主要的病理特征为老年斑沉积、神经原纤维缠结和tau蛋白磷酸化。tau蛋白是微管相关蛋白，含量占整个蛋白家族的80%，与微管的组装和稳定密切相关，对于神经细胞的生长发育、轴突生长、神经元极性形成、轴突的通信传导和物质运输等均有着至关重要的作用[2-3]。温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling为姜科姜黄属植物的干燥块根，在我国资源丰富，价格低廉，具有活血行气、破瘀、清心解郁之功效。课题组前期研究表明，温郁金挥发油可改善AD模型小鼠学习记忆障碍，减轻神经元的损伤，但其作用机制尚不清楚。本实验观察温郁金挥发油对AD模型小鼠tau蛋白磷酸化的影响，探讨其相关的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，8周龄，体质量（20±2）g，辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2010-0001。饲养于辽宁中医药大学附属第二医院实验动物中心，室温20～23 ℃，湿度50%～60%，自由饮水进食。

1.2 药物

温郁金购自浙江温州，经辽宁省中医药研究院药学室尤献民研究员鉴定为正品，符合2010年版《中华人民共和国药典》项下规定。挥发油提取：取温郁金药材1 kg，加水6000 mL，提取挥发油8 h，收得挥发油4.5 mL，辽宁省中医药研究院制剂中心制备，药液置于4 ℃冰箱保存备用。参枝苓口服液，山东沃华医药科技股份有限公司，批号5250101；盐酸多奈哌齐片，卫材（中国）药业有限公司，批号140606A。

1.3 主要试剂与仪器

Aβ25-35（Sigma公司），tau-5（Invitrogen 公司），rabbit anti-phospho-tau（Thr231）抗体、rabbit antiphospho-tau（Ser404）、rabbit anti-PI3K p85抗体、rabbit anti-phospho-PI3 K抗体、rabbit anti-phospho-Akt抗体，北京博奥森生物技术有限公司；Akt抗体，Santa公司；抗β-actin鼠单克隆抗体，康为世纪生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司；即用型SABC（兔IgG）试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；水合氯醛，天津市津东试剂厂。DW-200脑立体定位仪（成都泰盟科技公司），TD1002B电子台秤（四川中泯科技公司），Western blot电泳仪（美国BIO-RAD公司），BX51显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[4]方法并加以改进，小鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，固定于脑立体定位仪上。头部皮肤常规碘酒、酒精消毒，沿颅骨中线切开约2 cm切口，确定囟门位置，囟门后0.5 mm、旁开1 mm距离移动微量进样器，进针3 mm，注入3 μL老化的Aβ25-35，2 min内缓慢注入侧脑室内，留针5 min，创口处涂抹青霉素钠粉，肌注青霉素钠注射液，鼠笼饲养，注意保暖。假手术组注入等量生理盐水。

2.2 分组及给药

手术后第2日，除假手术组外，其余小鼠按体质量随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组（1.3 mg/kg）、参枝苓组（2.6 mL/kg）和温郁金低剂量组（6.0 mg/kg）、温郁金高剂量组（18.0 mg/kg），每组10只。各给药组给予相应药物灌胃，假手术组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积为20 mL/kg，每日1次，连续15 d。

2.3 免疫组化检测小鼠tau蛋白磷酸化位点（Ser404和Thr231）的表达

末次给药后1 h，每组取小鼠6～7只，腹腔注射3.5%水合氯醛10 mL/kg麻醉，卧倒后剪开胸腔，暴露心脏，将输液针经心尖刺入左心室，右心耳处剪一小口，先用预冷生理盐水快速灌注，待右心房流出液体变透明时，将输液针连接至预冷的4%多聚甲醛，先快后慢灌注，直至肝脏发白、四肢及尾巴抽搐、僵硬时，断头取脑，4%多聚甲醛4 ℃固定，常规制作成5 μm厚的石蜡切片，常规脱蜡脱水，高压修复，5%BSA封闭，滴加一抗，4 ℃过夜，PBS洗涤后，滴加二抗，DAB显色，镜下观察。每只各取10张冠状切片，每张切片随机选取5个不同的视野，阳性结果为细胞内现棕黄色颗粒，用JEOA 801D形态学图像分析系统计算各组阳性细胞平均光密度值。

2.4 Western blot检测小鼠tau蛋白磷酸化位点（Ser404和Thr231）及PI3K/Akt蛋白表达

末次给药后1 h，每组取3只小鼠快速断头，冰上分离海马，称重。小鼠海马经蛋白裂解液裂取后提取总蛋白，BSA法测定蛋白浓度，10%凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗孵育，4 ℃静置过夜。PBS洗涤后加入二抗孵育，再次洗涤后加入超敏

Effects of Wenyujin Essential Oil on tau Protein Phosphorylation in Mice with Aβ-induced Alzheimer Disease through PI3k/Akt Pathway

QI Yue1, QIN Wen-yan1, KANG Kai2, JIANG Hong1,

LI Zhao2, WANG Ya-bin2, JIA Dong2(1. Department of Pharmacology, The Second Hospital Affiliated to Liaoning Chinese Medical University, Shenyang 110034, China; 2. Laboratory Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China)

Objective To investigate the effects of Wenyujin essential oil on tau protein phosphorylation in mice with Alzheimer Disease (AD); To discuss the relevant mechanism of action. Methods Sixty Kunming mice were divided into six groups randomly: sham-operation group, model group, Wenyujin essential oil low- and high-dose group, donepezil group and Shenzhiling group. β-Amyloid protein (Aβ25-35) was infused into the hippocampal of mice. Mice in each group were given relevant medicine for gavage for 15 d. After the last administration, immunohistochemistry was used to detect the expressions of tau protein phosphorylation points (Ser 404 and Thr 231). Western blot was used to detect tau protein phosphorylation points and the expression of PI3K/Akt protein. Results Compared with sham-operation group, tau protein phosphorylation points in the model group increased (P＜0.05), but the phosphorylation levels of PI3K and Akt decreased significantly (P＜0.05). Compared with the model group, tau protein phosphorylation (Thr231 and Ser404) in Wenyujin essential oil high-dose group decreased significantly (P＜0.05), and the phosphorylation levels of PI3K and Akt increased (P＜0.01). Conclusion Wenyujin essential oil can inhibit tau protein phosphorylation in mice. The possible mechanism may be related to the PI3K/Akt signal pathway.

Wenyujin essential oil; Alzheimer disease; tau protein; PI3K/Akt; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.012

R285.5

A

1005-5304(2017)01-0045-04

国家科技重大专项-重大新药创制（2012ZX09102201-005）

贾冬，E-mail：jiadg2003@126.com