黄芩素延缓大鼠心肌衰老的作用及机制

李爽，刘璐，胡宝荣，张婧，宋永熙，海鑫

(哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001)

黄芩素延缓大鼠心肌衰老的作用及机制

李爽，刘璐，胡宝荣，张婧，宋永熙，海鑫*

(哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：研究黄芩素是否具有延缓大鼠心肌衰老的作用及机制。方法：将75只成年SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和黄芩素高中低剂量组(200、100、50 mg/kg)，正常对照组每日皮下注射生理盐水(10 mL/kg)，其余4组均每日皮下注射D-半乳糖生理盐水溶液(150 mg/kg)连续30天，建立衰老模型，同时黄芩素各剂量组大鼠灌胃相应药物，正常对照组与模型组灌胃等体积生理盐水。给药30天后，采用超声心动仪对动物心脏功能进行评价，检测各组大鼠心肌组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量。SA-β-gal活性检测试剂盒检测心肌组织β-半乳糖苷酶活性。Western blot衰老相关蛋白p21Cip1/Waf1及p53表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠心脏功能下降，左室射血分数、短轴缩短率降低(P<0.01)；心肌组织β-半乳糖苷酶活性明显增加(P<0.01)；血清与心肌中的SOD和GSH-Px下降，MDA含量增加(P<0.01)，衰老相关蛋白p21Cip1/Waf1及p53表达增加。与模型组比较，黄芩素组大鼠心脏功能增加，MDA含量下降，SOD和GSH-Px水平升高，衰老相关蛋白p21Cip1/Waf1及p53表达降低，且呈剂量相关性，高剂量组改善更明显。结论：黄芩素对大鼠心肌衰老有一定的延缓作用，其机制可能与提高衰老心肌抗氧化能力，抑制其下游p53/p21Cip1/Waf1信号通路有关。

黄芩素；抗衰老；大鼠；氧化损伤；心脏

随年龄增长，人体各器官会逐渐衰老，但心脏的衰老对机体的影响尤为主要。心肌细胞衰老与心血管疾病的发生密切相关，可导致心脏功能下降，进而诱发心力衰竭等心血管疾病。目前，缺少对于心肌细胞衰老所致心血管疾病的有效治疗药物。如果能找到有效延缓心肌细胞衰老的药物，这将为心血管疾病的防治带来巨大希望。

黄芩素是从植物黄芩的干燥根中提取分离的黄酮类化合物，是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、清除自由基、抗氧化[1]等作用。然而，黄芩素在D-半乳糖致大鼠衰老模型中对心肌的作用及机制尚不明确。因此本实验采用国内外广泛应用[2-3]的D-半乳糖诱导衰老模型，观察黄芩素对衰老模型大鼠血清和心肌组织中衰老相关生化指标的影响及心脏功能变化，探讨黄芩素对衰老心肌的抗氧化作用、抗衰老作用及其机制。

1 材料

1.1 仪器

XP204分析天平(中国梅特勒-托利多公司);CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司);ST16R低温离心机(美国ThermoFisher公司);VEVO小动物超声成像系统(加拿大VisualSonics公司);Westernblot凝胶电泳仪、转膜仪(美国Bio-rad公司);Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国Li-cor公司)。

1.2 药品与试剂

黄芩素(批号B802463，质量分数>98%,上海麦克林生化科技有限公司)；D-半乳糖(上海麦克林生化科技有限公司，批号：D810318，纯度≥98%)；0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司，批号：H20056626)；SOD 活力检测试剂盒、MDA 含量检测试剂盒、GSH-Px活力检测试剂盒均由中国碧云天生物技术公司提供；组织 β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒(中国杰美基因医药科技有限公司)；GAPDH 抗体(中国康城生物工程有限公司)、p21抗体(美国 BD Pharmingen 公司)、p53抗体(美国 Cell Signaling Technology 公司)。

1.3 动物

健康雄性成年SD大鼠75只，300～400 g，均由哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心提供。购入后，稳定饲养1周，室温23～26 ℃，湿度50%～70%，自由进食饮水。

2 方法

2.1 造模、分组与给药

将大鼠随机分为5组，每组15只，分别为正常对照组、模型组和黄芩素高剂量组(200 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)、低剂量组(50 mg/kg)。除正常对照组每日皮下注射等量生理盐水(10 mL/kg)外，其他4组每日皮下注射D-半乳糖生理盐水溶液(150 mg/kg)连续 30天，第 31 天之后，在注射D-半乳糖溶液同时各组灌胃相应药物，正常对照组、模型组与其他3组灌胃等体积生理盐水，持续给药30天。大鼠每日给药 1次，每周称量体质量，调整给药剂量，实验过程连续给药60天(D-半乳糖生理盐水溶液造模30天+黄芩素给药30天)，自由饮水[4-6]。

2.2 指标检测

2.2.1 超声心动仪检测心脏功能

末次给药后，麻醉各组大鼠，剔除胸毛并涂抹耦合剂后，应用心脏超声波检测实验动物的心脏功能，分别测定各组大鼠左室舒张末期内径(LVDd)、左室收缩内径(LVSd)、左室收缩末容积(ESV)、左室舒张末期容积(EDV)、左室射血分数(EF)以及短轴缩短率(FS)等指标，每只动物取5个心动周期数据进行统计分析。

2.2.2 心肌组织衰老特异性 β-半乳糖苷酶活性检测

麻醉各组大鼠，摘取心脏，清洗后速冻，取适量组织放入管中，加入裂解液，冰上研磨使其裂解充分，研磨后冰上静置，每10 min涡旋一次，共涡旋3次。将其转移至4℃离心机2 000 r/min离心15 min。离心后转移上层蛋白至管中，测定蛋白浓度后备用。取上述悬液10 μL加入至96孔板中，每孔加入 150 μL 试剂盒内的稀释液 C，震荡使其均匀混合，37℃孵育15 min。每孔加入50 μL反应液D，混匀后将96孔板放入37℃孵箱内20 min。待样品呈黄色时，每孔加入90 μL终止液E。酶标仪420 nm波长下检测样品吸光度值。

2.2.3 心肌组织SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量检测

末次给药后，麻醉各组大鼠，摘取心脏，取适量心肌组织，用PBS水清洗组织1～2次。加入裂解液后裂解组织，之后将其放入4℃离心机中2 000 r/min离心15 min，取上清测定每组蛋白浓度。按试剂盒说明书的步骤分别测定心肌组织中的SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量。

2.2.4 蛋白免疫印迹检测衰老相关蛋白p21Cip1/Waf1及p53表达水平

摘取心脏，清洗后速冻，取适量组织放入管中，加入裂解液，裂解细胞并提取总蛋白。根据 BCA 蛋白定量法检测各蛋白浓度，根据各蛋白浓度配置蛋白加样体系。依次进行配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，孵育一抗、二抗，采用凝胶成像系统进行扫膜，扫描系统检测各蛋白条带，Odyssey分析软件计算各蛋白条带光密度值。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 黄芩素对D-半乳糖致大鼠衰老心脏功能的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠心脏功能明显下降，其表现在射血分数和短轴缩短率降低，心脏左室收缩、舒张末期内径增加及左室收缩、舒张末期容积增大(P<0.01)，表明模型复制成功。与模型组比较，黄芩素各剂量组大鼠射血分数和短轴缩短率显著升高(P<0.01)，左室收缩末期内径(LVsd)及容积(ESV)均有所减小，且黄芩素改善心脏功能作用呈量-效关系，见表1。

表1 各组大鼠心脏功能的测定结果

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01

3.2 黄芩素对D-半乳糖致大鼠心肌β-半乳糖苷酶活性的影响

与正常对照组比较，模型组中心脏组织的β-半乳糖苷酶活性明显升高(P<0.01)，表明造模成功。与模型组比较，黄芩素高、中、低剂量组大鼠心肌β-半乳糖苷酶活性依次降低(P<0.01)，见图1。

图1 各组大鼠心肌β-半乳糖苷酶活性的测定结果注：与正常组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01

3.3 黄芩素对D-半乳糖致大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活力、MDA含量的影响

心肌中SOD、GSH-Px的活力，MDA含量与正常组比较，模型组大鼠心肌中SOD、GSH-Px活力显著降低，MDA含量明显升高(P<0.01)，表明造模成功。与模型组比较，黄芩素各剂量组大鼠心肌中SOD、GSH-Px活力明显升高(P<0.01)，且活力水平与剂量呈正比，以高剂量组升高更明显著，MDA含量明显下降(P<0.01)。各组大鼠心肌中SOD、GSH-Px活力、MDA含量见表2，图2。

表2 各组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活力、MDA含量的测定结果

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01

图2 各组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活力、MDA含量的测定结果注：与正常组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01

3.4 黄芩素对D-半乳糖致大鼠心肌组织衰老相关蛋白p21Cip1/Waf1及p53表达水平的影响

与正常对照组相比，模型组p21Cip1/Waf1、p53蛋白表达量显著升高(P<0.01)，说明造模成功。与模型组相比，黄芩素各剂量组大鼠心肌中p21Cip1/Waf1、p53蛋白表达量明显下降(P<0.01)且下降水平与剂量呈正比，以高剂量组下降更明显著(P<0.01)，见图3。表明黄芩素发挥延缓心肌衰老的作用可能是通过抑制p53-p21Cip1/Waf1信号通路实现的。

4 讨论

机体衰老伴随着全身各器官组织结构逐渐衰退，生理功能下降[7]。心脏是人体至关重要的脏器，负责全身各器官组织的血液供应。心肌组织细胞的衰老会导致心脏心肌收缩力降低，心输出量减少[8]。导致心肌衰老的多种发生机制中，氧化应激受到各国各界学者的认可，氧化应激在心肌衰老的过程中同样扮演着重要角色[9]。机体衰老可导致使机体产生大量自由基，发生过氧化反应，使之产生的丙二醛含量增加，自由基过多，导致超氧化物歧化酶活力下降，自由基的清除能力下降导致氧化与抗氧化的平衡打破。多研究表明p53可调节细胞衰老，p21Cip1/Waf1作为其下游靶基因，表达异常亦可影响细胞的衰老[10]。D-半乳糖广泛应用于各类衰老动物模型，主要机制是机体内半乳糖浓度升高，发生氧化反应，D-半乳糖被氧化成醛类和 H2O2，超氧阴离子和自由基产量增加，导致细胞内脂质、蛋白和核酸等大分子损伤[11]，引起全身各器官功能衰退，最终加速衰老。本研究采用D-半乳糖诱导大鼠衰老模型连续30天，我们的实验结果显示，衰老心肌组织细胞中衰老特异性标志物β-半乳糖苷酶含量增高，抗氧化酶SOD、GSH-Px活力下降、MDA 含量升高，衰老调信号转导通路p53-p21Cip1/Waf1激活，可判定衰老动物模型建造成功，并证实了D-半乳糖诱导衰老模型大鼠与机体内自由基过量，抗氧化酶活力减少等因素相关。这一造模技术手段已被广泛应用于与衰老相关等方面领域研究[12]。

图3 各组大鼠心肌组织衰老相关蛋白p21Cip1/Waf1及p53表达水平的测定结果注：与正常组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01

黄芩素可有效的清除自由基、并起到抗氧化剂作用，并应用于治疗与氧化应激相关的多种疾病，并且相关研究已证实黄芩素可以减少氧化应激反应、炎症反应的发生，对心肌细胞起到保护作用[13]。本研究首次发现黄芩素具有延缓大鼠心肌衰老、增强大鼠衰老心脏功能的作用。模型组出现心肌细胞衰老表型，表现为心输出量降低、心肌收缩力减少。心脏衰老最显著的表征即为心肌细胞收缩功能下降，心输出量减少，心室壁张力降低[14-15]。本研究结果显示黄芩素各剂量组对衰老模型各项衰老指征均有明显改善作用，且呈剂量依赖性。黄芩素各剂量组可增大心输出量、心肌收缩力，左室收缩末期容积减少，增强衰老心脏的功能。本研究结果显示黄芩素可有效降低衰老组织特异性标志物β-半乳糖苷酶活性，且可提高模型大鼠的抗氧化能力，增强老龄大鼠心肌组织SOD、GSH-Px 活性、降低MDA含量，有效降低衰老所致的氧化应激反应。本研究同时发现黄芩素参与了心肌衰老过程中衰老相关分子 p53、p21Cip1/Waf1的调控，发挥其延缓大鼠心脏衰老的作用。

综上所述，黄芩素对D-半乳糖所致大鼠心肌衰老有一定的延缓作用。黄芩素可增强老龄大鼠心肌组织抗氧化能力，改善心肌衰老、延缓机体衰老的作用，其机制与有效抑制p53-p21Cip1/Waf1信号转导通路有关。

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MyocardialProtectiveEffectofBaicaleinonAgingRatsInducedbyD-galactose

LI Shuang, LIU Lu, HU Bao-rong, ZHANG Jing, SONG Yong-xi, HAI Xin

(TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective: To study the protective effect of baicalein on the aging model rats and explore the underlying mechanism. Methods: 75 rats were randomly divided into the blank control group, the model group, high-dose baicalein group(200mg/kg), medium-dose baicalein group(100 mg/kg), and low-dose baicalein group(50 mg/kg), with 15 rats in each group. The aging models were established by the injection of D-galactose solution(150 mg/kg) for 30d, whereas the blank control group was injected saline(10 mL/kg). Different concentrations of baicalein were applied to the rats in baicalein groups for 30d after modeling, at the same time, same volume of saline was given to the blank control group and the model group. Cardiac function was evaluated with Echocardiography, and SOD, GSH-Px and MDA were tested in the myocardium. SA-β-gal activity and expressions of p21Cip1/Waf1and p53 were examined. Results: Compared to blank control group, in the model group, the cardiac function of aging rats was declined(P<0.01); the activity of SOD and GSH-Px in the myocardium were decreased significantly(P<0.01); SA-β-gal-positive cells and MDA contents in the myocardium were increased significantly(P<0.01); expressions of p53 and p21Cip1/Waf1were also increased; Compared to the model group, the cardiac function in the baicalein groups was improved; the activities of SOD and GSH-Px in myocardium were increased significantly, with decreased MDA SA-β-gal-positive cells in the baicalein groups(P<0.01); the expressions of p53 and p21Cip1/Waf1were also significantly decreased in baicalein groups. The anti-aging effect of baicalein was dose dependent, the high-dose group improved more than the other two groups. Conclusion: Baicalein has obvious protective effect on myocardial cells in aging rats induced by D-galactose, the mechanism may be related to the decreased oxidative stress level and inhibiting its downstream p53/p21Cip1/Waf1signaling pathway, improving heart function in aging rats.

Baicalein; Anti-aging; Rats; Oxidative stress; Heart

R285.5;R322.1

A

1002-2392(2017)06-0057-05

2017-09-06

2017-11-18

李爽(1988-),女,药师,硕士研究生(药理),研究方向：临床药学、药理学。

*通讯作者：海鑫(1983-),女,博士,主任药师,研究方向：医院药学。