人参皂苷Rb1对川崎病小鼠治疗作用的研究

邹悦，康乃馨，王彦儿，胡超，刘音贝，杨世林*，刘艳丽*，许琼明，李云秋，李冀，李笑然

(1.桂林医学院，广西 桂林 541000；2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123；3.广东药科大学，广东 广州 510006；4.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025；5.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

人参皂苷Rb1对川崎病小鼠治疗作用的研究

邹悦1，康乃馨2，王彦儿3，胡超4，刘音贝1，杨世林1*，刘艳丽2*，许琼明2，李云秋1，李冀5，李笑然2

(1.桂林医学院，广西 桂林 541000；2.苏州大学药学院，江苏 苏州 215123；3.广东药科大学，广东 广州 510006；4.贵州医科大学，贵州 贵阳 550025；5.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：用干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)诱导川崎病(KD)小鼠模型，探讨人参皂苷Rb1治疗川崎病小鼠的作用。方法：LCWE组小鼠每只腹腔注射LCWE 0.5 mL(1 mg/mL)，Rb1组给予20 mg/kg和40 mg/kg Rb1治疗，ASP组灌胃给予250 mg/kg ASP治疗。观察实验期间小鼠的变化，对小鼠进行眼眶取血并解剖心、脾、肾、胸腺等脏器进行病理切片，以及对小鼠血液进行血常规检验和测定血清中的肿瘤坏死因子(TNF-a)的含量。结果：小鼠体质量明显降低，血常规检测LCWE造模组白细胞(WBC)含量明显升高，Rb1组下降。血清中肿瘤坏死因子(TNF-a)含量明显升高，Rb140 mg/kg组下降。病理切片显示LCWE造模组冠状动脉血管壁增厚并伴有炎性浸润，Rb1组血管壁变薄炎性浸润减少。结论：人参皂苷Rb1对川崎病小鼠有一定的治疗作用。

人参皂苷Rb1；川崎病；干酪乳杆菌细胞壁提取物；冠状动脉；炎性因子

川崎病(Kawasaki disease)是一种急性发热性黏膜与皮肤的淋巴结综合征和多系统血管炎影响婴儿和不到5岁的儿童[1]。诊断是建立在临床上六个主要症状的存在，包括大于5天不明原因的发热，发红、脱皮的手掌和脚底，多形性皮疹，结膜充血、草莓舌和颈部淋巴结病变[2]。目前川崎病的病因及发病机制不清楚，可能与免疫失调和多种血管活性因子引起的血管炎性损伤有关[3]。

人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)是人参二醇系皂苷，其属于达玛烷型三帖皂苷类化合物，有多种生物活性[4]。人参皂苷Rb1是三七、西洋参、人参的主要化学成分之一，相对分子质量1 109.26。人参皂苷具有多重药效，可以作用于循环系统、心血管系统、内分泌系统、免疫系统和神经系统等重要系统[5-7]。人参皂苷Rb1研究[8]发现人参皂苷可以控制中性粒细胞活化募集，减少组织炎症损伤，通过多途径调节细胞因子的释放，减轻全身及局部炎症反应损伤程度，减少单核/巨噬细胞活化聚集，参与了环氧合酶(COX)介导的炎症反应[9]。在本课题实验中发现人参皂苷Rb1能改善川崎病模型的症状,旨为临床治疗提供实验数依据。

1 材料

1.1 仪器

ThermoMultiskan FC型酶标仪(德国Thermo Scientific 公司)；VCX130型细胞超声破碎仪(美国SONICS公司)；X85-2恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器有限公司)；电热恒温水槽THS-10(宁波天恒仪器厂)；电子天平BSA223S(赛多利斯科学仪器有限公司)；-80℃冰箱(美国Thermo公司)；立式压力蒸汽灭菌器LD2X-75KB(上海中安医疗器械厂)；高速冷冻离心机JA25.5(美国贝克曼库尔特公司)；恒温双层震荡培养箱HZQ-X100(太仓市华利达实验设备有限公司)；双人净化工作台(苏净实业有限公司)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.2 药物与试剂

干酪乳杆菌购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心(GIMCC)；MRS肉汤购于solarbio公司；PBS购于solarbio科技有限公司；阿司匹林肠溶片购于国药；DNA酶、RNA酶和胰蛋白酶购于上海源叶生物科技有限公司；人参皂苷Rb1购于江西本草天工科技有限责任公司；蒽酮购于上海源叶生物科技有限公司，鼠李糖购于adamas-beta科技有限公司。

1.3 动物

清洁级，BALB/C小鼠，雄，4～5周龄，由昭衍(苏州)新药研究中心有限公司提供，许可证号：SCXK(苏)2013-0003。

2 方法

2.1 干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)的制备

取干酪乳杆菌菌种加入适量的MRS肉汤培养基，待菌种溶解后接种于乳酸杆菌琼脂培养基中并置于37℃培养箱厌氧培养2天。将培养物分装于无菌的离心管中，5 000 r/min离心30 min，弃上清，用无菌的PBS充分洗涤，离心，反复7次，沉淀中以10倍体积加入4% SDS室温过夜，5 000 r/min离心40 min弃上清留沉淀，加入PBS洗涤，离心，反复10次，以去除细胞碎片和SDS，沉淀以10倍体积依次加入250 μg/mL RNA酶、250 μg/mL DNA酶250 μg/mL胰蛋白酶放37℃培养箱中消化处理4 h，每一次消化后10 000 r/min离心40 min，PBS吹洗2次，离心留沉淀，以4倍体积PBS重悬，在冰上用细胞破碎仪超声破碎，振幅300 W，超声5 s、停4 s、20次1个循环，每个循环停3 min，超声2 h。超声处理完成后，40 000 r/min离心1 h，上清液即是LCWE，上清液用0.22 μm的滤膜过滤，分装于离心管中放-80℃冰箱保存备用。

2.2 LCWE浓度测定

2.2.1 标准液的配制

称取0.32 g鼠李糖溶于100 mL蒸馏水中配成3.2 mg/mL溶液，作为标准母液，以标准母液为基准等梯度稀释各标准曲线浓度(1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL)。

2.2.2 样品稀释

取100 μL LCWE原液，做2、10、20、50倍稀释。

2.2.3 浓度测定

取96孔板置冰上，每孔加入20 μL样品和标准品最后每孔加入80μL的蒽酮硫酸(沿壁缓慢加入防止碳化)，沸水中煮15 min，冷却30 min，用酶标仪测吸光度，根据吸光度值绘制标准曲线，最终求出样品浓度。

2.3 动物实验

取4～5周BALB/C雄性小鼠共50只，每组各10只，染色随机平均分为正常组(A组)、KD造模组(B组)、阿司匹林250 mg/kg组(C组)、人参皂苷Rb120 mg/kg(D组)和40 mg/kg(E组)。除正常组外，其它实验组小鼠单次腹腔注射0.5 mL LCWE (1 mg/mL)，正常组小鼠腹腔给于等体积的生理盐水。治疗组小鼠给予不同剂量的阿司匹林和Rb1，连续给药7天。实验期间每天称重，观察小鼠的饮水进食、活动和一些基本情况。实验结束时，眼球取血于EDTA抗凝管中进行血常规检测，离心取血清，用ELLSA法测定血清中的TNF-α含量，取心脏做病理切片进行冠状动脉形态学检查。

2.4 统计分析

3 结果

3.1 人参皂苷Rb1对LCWE诱导川崎病小鼠的体质量影响

小鼠单次注射LCWE几个小时后小鼠出现腹泻、喜蜷缩，身体颤抖现象，注射3天后可看到小鼠皮毛无光泽、毛发稀疏、饮水、进食、自主活动明显减少。生理盐水组没有此现象，小鼠体质量增加。Rb1组和阿司匹林组小鼠较造模小鼠要好。说明KD小鼠造模成功，Rb1有改善KD小鼠的作用。结果见表1：与A组相比，B组小鼠的体质量明显下降(P<0.01)，D组和E组小鼠体质量增加且与B组相比有显著性差异(P<0.01)，体质量下降抑制率分别为4.89%、10.63%、8.06%。

表1 人参皂苷Rb1对小鼠体质量的影响

注：与A(正常组)比较，##P<0.01；与B(造模组)比较，*P<0.05，**P<0.01

3.2 人参皂苷Rb1对川崎病小鼠心脏病理形态的影响

正常组小鼠冠状动脉血管壁正常，LCWE造模组小鼠冠状动脉血管壁增厚且血管周围有明显的炎性细胞浸润，阿司匹林和Rb1给药组冠状动脉血管壁变薄，周围炎性细胞浸润减少,结果见图1。

3.3 人参皂苷Rb1对川崎病小鼠心脏指数的影响

与正常组相比，造模组小鼠心脏指数明显下降，差异显著有统计学意义(P<0.01)。与造模组相(B组)比，Rb1组(D组)和阿司匹林组(E组)小鼠心脏指数升高接近于正常组(A组)，Rb140 mg/kg剂量组(D组)和阿司匹林组(E组)差异显著有统计学意义(P<0.05、0.01)，结果见表2:C、D、E组心脏指数抑制率分别为19.35%、29.90%、24.24%。

图1 各组小鼠心脏组织HE染色结果(400×)

组别心脏指数(mg/g)心脏指数抑制率(%)A0.14±0.019—B0.075±0.025##—C0.093±0.01519.35D0.107±0.016**29.90E0.099±0.015*24.24

注：与A(正常组)比较，##P<0.01；与B(造模组)比较，*P<0.05，**P<0.01

3.4 人参皂苷Rb1对川崎病小鼠血液标本WBC、BASO、LYM%及EOS%结果

正常组、造模组、Rb1组和阿司匹林组分别眼球取血进行WBC、BASO、LYM%及EOS%检验，结果显示造模组(B组)小鼠的WBC、BASO数量明显升高，Rb1组(D组)和阿司匹林组(E组)小鼠的WBC和BASO数量均下降，其中Rb120 mg/kg剂量组(C组)和阿司匹林组(E组)分别与模型组(B组)相比，都有显著性差异(P<0.05、0.01)但Rb140 mg/kg剂量组差异无统计学意义。B组LYM%的比例与正常组比较显著下降，C、D组和E组LYM%的比例升高，分别与B组相比且都有显著性差异。与A组比较B组EOS%的比例显著下降，D组和E组与B组相比，EOS%的比例呈上升趋势且都有显著性差异，Rb120 mg/kg剂量组(C)组差异无统计学意义，结果见表3。

表3 人参皂苷Rb1对川崎病小鼠血液标本WBC、BASO、LYM%及EOS%结果

注：与A(正常组)比较，##P<0.01；与B(造模组)比较，*P<0.05，**P<0.01

3.5 人参皂苷Rb1对川崎病小鼠血清中TNF-α含量的影响

正常组、造模组、Rb1组分别检测血清中的TNF-α，结果造模组(B组)小鼠的TNF-α含量明显升高，Rb140 mg/kg组(D组)TNF-α含量明显下降。结果见表4。

表4 Rb1对小鼠血清中TNF-α含量的影响

注：与A(正常组)比较，##P<0.01；与B(造模组)比较，*P<0.05

4 讨论

川崎病是一种自身免疫性疾病，可引起全身性血管炎主要好发于5岁以下的儿童，是儿童患先天性心脏病的主要原因。由于临床治疗川崎病的手段比较局限，取材比较困难，所以建立川崎病动物模型对于深入研究具有重大的意义。目前，国内外关于川崎病动物模型方面的研究主要使用 的造模因子均基于超抗原学说，多使用LCWE[10]或白色念珠菌提取物(CADS)[11]作为造模药物，使用卡介苗(BCG)[12]、牛血清清蛋白[13]作为造模药物的研究较少Lehman等[14]将LCWE注射入小鼠后能产生类似KD冠脉炎，证明LCWE可以通过超抗原机制引起冠脉损伤，所以本实验室选取4～5周龄BALB/C雄性小鼠用干酪乳杆菌细胞壁提取物作为诱导剂，构建川崎病模型，本模型的病理改变以冠状动脉血管炎为主表现为冠状动脉血管中膜增厚，周围有炎性细胞浸润，处于川崎病急性期的小鼠，血清中的TNF-α含量升高，这与国内外文献[15-18]报道构建川崎病模型的病理改变的结果一致，表明在本次实验条件下，成功诱导了KD小鼠模型，而本实验中人参皂苷Rb1能改善由干酪乳杆菌诱导的川崎病模型的炎症反应。目前川崎病的治疗以激素加静脉用丙种球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)加乙酰水杨酸(阿司匹林，acetylsalicylic acid，ASA)作为初始治疗方案[19]。尽管川崎病的传统治疗是有效的，但很大一部分的儿童仍有冠状动脉异常的病变[20]。目前国内外没有关于人参皂苷Rb1治疗川崎病的文献报道，随着对人参皂苷Rb1的深入研究，人参皂苷Rb1的作用和机制会逐步阐明进而为人类造福。因此，人参皂苷Rb1的临床应用研究尚有更多的工作要做，其抗炎作用及其抗炎作用机制值得进一步研究。

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EffectofGinsenosideRb1onKawasakiDiseaseinMice

ZOU Yue1, KANG Nai-xin2, WANG Yan-er3, HU Chao4, LIU Yin-bei1, YANG Shi-lin1, LIU Yan-li2, XU Qiong-ming2, LI Yun-qiu1, LI Ji5, LI Xiao-ran2

(1.GuilinMedicalCollege,Guilin541000,China; 2.DepartmentofPharmacy,SoochowUniversity,Suzhou215123,China; 3.GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 4.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 5.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To explore the effect of Ginsenoside Rb1 on Kawasaki disease(KD) in mice. Methods: Lactobacillus casei cell wall extract(LCWE, 1 mg/mL, ip) was used to induce KD model. The mice were randomly divided into the control group, the model group, Rb1 groups(20 mg/kg, 40 mg/kg), and ASP group (250 mg/kg). Then the changes of mice during the experiment were observed. Orbital blood samples were collected and the tissue samples of the heart, spleen, kidney and thymus were collected for HE staining, and TNF-a level was measured. Results: Body weight of the mice had decreased, WBC levels increased significantly in the model group, compared to the control group, but Rb1 inhibited the effect of LCWE. TNF-a level was significantly increased after modeling, but it was decreased in Rb1 group(40 mg/kg). Pathological measure showed that the coronary artery wall was thickened with serious inflammatory infiltration in the model group, vascular wall became thinner with less inflammatory infiltration in Rb1 groups. Conclusion: Ginsenoside Rb1 has a certain therapeutic effect on KD in mice.

Ginsenoside Rb1; Kawasaki disease; Lactobacillus cell wall extract; Coronary artery; Inflammatory factor

R285.5

A

1002-2392(2017)06-0040-05

2017-09-06

2017-10-05

国家自然科学基金项目(81273402；81573548)

邹悦(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：新药研发与转化。

*通讯作者：杨世林(1953-)，男，教授，研究方向：新药研发与转化。刘艳丽(1974-)，女，副教授，研究方向：中药抗肿瘤活性成分和机制。