黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响

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(廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北 廊坊 065001)

黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响

宫卫波，王海雷，程国平，赵津津

(廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北 廊坊 065001)

以黄色短杆菌MH-1000为出发菌株，使用PCR技术克隆ilvBN与ilvC基因，对ilvBN进行定点突变，获得解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶反馈抑制突变型基因ilvBN′.对基因ilvC进行点突变，获得乙酰羟酸变位酶突变基因ilvC′.通过重叠延伸PCR方法，将基因片段ilvBN′和ilvC′拼接为ilvBN′C′，进而连接至穿梭载体pXMJ19获得重组质粒pXMJ19-ilvBN′C′.该重组质粒转化至出发菌株获得工程菌株MH-1032.50 L分批补料发酵结果显示：MH-1000发酵72 h L-缬氨酸质量浓度为35.2 g/L，MH-1032发酵72 h L-缬氨酸质量浓度为38.4 g/L，增长9.1%，糖酸转化率从21.7%提高到25.8%.

L-缬氨酸；乙酰羟酸合酶；乙酰羟酸变位酶；黄色短杆菌

L-缬氨酸作为增味剂、添加剂，应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域.L-缬氨酸是人体必需八种氨基酸之一.工业上主要使用发酵法生产L-缬氨酸，所用菌种以棒杆菌为主.一般通过增强L-缬氨酸代谢通路关键酶、限速酶的表达[1-2]，阻断或者减弱支路代谢[3-4]，改变细胞膜对底物和产物透性，增强细菌对糖等底物的耐受，抑制终产物分解[5-7]等方法提高L-缬氨酸产量.另外优化发酵培养基配方、改善发酵工艺也可提高L-缬氨酸产量[8-9].徐庆阳等[10]以黄色短杆菌(B.flavum)XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)在10 L小罐中发酵72 h，最高产L-缬氨酸53.4 g/L，糖酸转化率为26.7%.张伟国等[11]通过诱变筛选出了XQ-8(Leulα+ABhr+2-TAhr+AHVhr)，摇瓶产酸达66 g/L.但是以诱变为基础的菌株筛选效率比较低，现基本被基因工程手段替代.

笔者采用对ilvBNC进行定点突变的方法，解除了L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶(AHAS)的反馈抑制，同时经过定点突变，将乙酰羟酸变位酶(AHAIR)的辅酶NADPH改为NADH，摇瓶发酵产L-缬氨酸19.5 g/L，比突变前提高16.8%；50 L发酵罐产L-缬氨酸38.4 g/L，比突变前提高9.1%.

1 材料与方法

1.1 材 料

大肠杆菌transT1(北京全式金生物技术有限公司)，黄色短杆菌MH-1000(α-ABhr+2-TAhr+AHVhr)，廊坊梅花生物技术开发有限公司保藏菌种.

大肠杆菌-棒杆菌穿梭质粒pXMJ19，本实验所使用的菌株及载体详见表1.

表1 本实验中细菌和质粒Table 1 Strains and plasmids in this experiment

1.2 试剂及设备

限制性内切酶、DNA连接酶，MBI Fermentas公司；Fast pfu DNA polymerase，TransStart FastTaq DNA polymerase，TransStart FastPfu DNA polymerase，DNA Marker，dNTPs等，北京全氏金生物技术有限公司；质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、基因组提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；引物合成及测序送交英潍捷基(上海)贸易有限公司完成；往复式摇床、恒温培养箱、PCR仪、电泳-凝胶成像系统等；SBA生物传感仪，山东省科学院微生物研究所；50 L发酵罐，上海百仑生物科技有限公司.

1.3 培养基

LB培养基：氯化钠10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，121 ℃灭菌20 min.

黄色短杆菌摇瓶及50 L小罐发酵培养基配制参考文献[11].LBHIS(LB with brain heart infusion and sorbitol)用于电转化后恢复培养，BHI(Brain heart lnfusion medium)感受态细胞培养等培养基配制参考文献[12-13].

黄色短杆菌斜面培养基LBG：LB培养基+0.5%葡萄糖，NaOH调节pH至7.0，121 ℃灭菌20 min.

黄色短杆菌种子培养基：葡萄糖25 g/L，尿素2.5 g/L，玉米浆40 g/L(氨基氮1.0%～1.3%，波美度19.5～22)，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，NaOH调节pH至7.0，121 ℃灭菌20 min.

黄色短杆菌50 L发酵培养基：葡萄糖50 g/L，玉米浆15 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，NaOH调节pH至 7.0，121 ℃灭菌20 min.

1.4 发酵以及数据测定

摇瓶发酵条件：摇床转速170 r/min，发酵温度33 ℃，时间72 h.发酵结束后加水定容至20 mL；吸取菌液0.1 mL，使用0.5 mol/L盐酸稀释至5 mL，分光光度计测量OD562；取1 mL菌液至1.5 mL的EP管中，12 000 r/min离心2 min，安捷伦液相色谱测定L-缬氨酸产量；吸取1.5 mL EP管中10 μL上清液至990 μL去离子水中，SBA生物传感仪测定发酵液剩余葡萄糖；50 L发酵罐发酵条件，样品测定参考文献[11].

1.5 感受态细胞制备及其他分子操作

大肠杆菌感受态细胞制备参考文献[14]，MH-1000感受态细胞制备参考文献[15-16].基因组提取、质粒提取、酶切和连接等按照试剂盒或说明书进行操作.引物设计参照黄色短杆菌ATCC14067相关基因(表2)，并添加相应的酶切位点和保护碱基.

1.6 ilvBN定点突变

提取黄色短杆菌基因组，使用引物ilvBN-F和ilvBN-R经PCR获得ilvBN.以ilvBN为模板，分别使用ilvBN-F，ilvBN-IR和ilvBN-IF，ilvBN-R扩增两个基因片段ilvB和ilvN.

利用重叠延伸PCR的方法，以ilvBN-F，ilvBN-R为引物，等摩尔浓度的ilvB，ilvN为模板PCR，TransStart FastTaq DNA polymerase，TransStart FastPfu DNA polymerase混合酶，体积比1∶10，体系50 μL包括：10 μL 5×Primer star buffer (Mg2+plus)，4 μL的dNTP混合物(各2.5 mmol/L)，引物各1 μL，混合酶1 μL，模板ilvB和ilvN适量，补水至50 μL.PCR条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，以上30 个循环；72 ℃延伸10 min.PCR结束后获得定点突变的ilvBN′.

表2 本实验中所用引物1)Table 2 Primers in this experiment

注：1) 表中带有下划线的碱基表示突变位点.

回收上步中PCR产物后，连接T载体pEASYTM-T5，获得pEASYTM-T5-ilvBN′，转化至大肠杆菌；使用M13为鉴定引物测序鉴定，提取质粒pEASYTM-T5-ilvBN′经Hind III与EcoR I酶切，回收ilvBN′片段，与相同酶切回收的pXMJ19连接，构建pXMJ19-ilvBN′.

转化pXMJ19-ilvBN′至大肠杆菌，平板培养，挑单菌落进行摇瓶过夜培养，提取质粒作为模板，以pX-F和pX-R为引物进行PCR测序鉴定；鉴定完毕获得阳性克隆后，提取质粒pXMJ19-ilvBN′转化MH-1000，转化条件、培养基配方参考文献[12-13]，以pX-F和pX-R为引物进行PCR测序鉴定筛选阳性克隆.

1.7 ilvC定点突变

提取黄色短杆菌基因组为模板，以ilvNC-F和ilvNC-R为引物PCR获得ilvNC；以ilvNC为模板，分别使用ilvNC-F，ilvC-IR和ilvC-IF，ilvNC-R为引物扩增两个基因片段ilvNCF和ilvCR.

利用重叠延伸PCR的方法，以ilvNC-F，ilvNC-R为引物，等摩尔浓度的ilvNCF和ilvCR为模板进行PCR，获得定点突变ilvC′，连接T载体pEASYTM-T5，构建pEASYTM-T5-ilvC′，转化至大肠杆菌，24 h长出菌落后，挑单菌落或摇瓶过夜培养后提质粒作为模板，T载体自带引物M13进行PCR鉴定，测序，序列正确可用于ilvBN′C′的重叠延伸PCR.

1.8 ilvBN′与ilvC′连接、转化

以ilvBN-F和ilvN-R为引物，ilvBN′为模板，扩增出ilvBN′F；以ilvNC-F和ilvC-R为引物，ilvC′为模板，扩增出ilvC′R.

回收上步骤中ilvBN′和ilvC′R基因片段，以ilvBN′F与ilvC′R为模板，以ilvBN-F和ilvC-R为引物，PCR扩增形成ilvBN′C′，条件基本同1.6.体系50 μL：包括10 μL 5×Primer star buffer(Mg2+plus)，4 μL的dNTP混合物(各2.5 mmol/L)，引物各1 μL，混合酶1 μL，模板ilvBN′和ilvC′R适量，补水至50 μL.PCR条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，以上30 个循环；最后72 ℃延伸10 min，连接T载体pEASYTM-T5，形成pEASYTM-T5-ilvBN′C′，使用M13引物、Hind III与EcoR I双酶切进行鉴定，鉴定阳性克隆测序.

摇瓶过夜培养测序正确的大肠杆菌，提取质粒pEASYTM-T5-ilvBN′C′，使用Hind III与EcoR I酶切，回收ilvBN′C′片段后，连接同样酶切回收的pXMJ19，构建质粒pXMJ19-ilvBN′C′，转化至大肠杆菌，长出菌落后挑单菌落为PCR模板，以pX-F和pX-R为引物进行PCR进行扩增，测序验证为阳性克隆后，提取质粒pXMJ19-ilvBN′C′转化MH-1000，再次以pX-F和pX-R为引物，以转化后菌株为模板进行PCR，测序筛选阳性克隆.

1.9 分批补料

50 L发酵罐发酵条件：接种量10%，通风比1 vvm，搅拌转速200～500 r/min，温度31 ℃，25%氨水流加调节pH至7.0，流加650 g/L高浓度葡萄糖补充碳源，控制溶氧30%～50%，发酵液葡萄糖质量浓度1～2 g/L.

2 结 果

2.1 ilvBN的定点突变及转化

将ilvBN从MH-1000菌株基因组上扩增，使用重叠延伸PCR方法进行定点突变，将AHAS小亚基别构中心的3个氨基酸做如下替换Gly20Asp，Ile21 Asp和Ile22 Phe，相应的的核苷酸GGAATCATT定点突变成GATGACTTT，解除了L-缬氨酸对AHAS的反馈抑制(图1)，获得定点突变基因.质粒pXMJ19-ilvBN′模板，以pX-F，pX-R为引物PCR验证如图2所示，ilvBN′大小约为2.5 kb(基因大小2 413 bp)左右(泳道2).构建的pXMJ19-ilvBN′C′经Hind III和EcoR I双酶切，有两条片段(泳道4)，质粒片段pXMJ19约为6.6 kb(质粒6 601 bp)，验证结果为阳性，获得MH-1031.

图1 ilvBN基因定点突变位点及其上下游序列测序图谱Fig.1 Site-directed mutation of ilvBN and related sequences

图2 质粒pXMJ19-ilvBN′C′的PCR及酶切验证Fig.2 Validation of pXMJ19-ilvBN′C′ through PCR and endonuclease digestion

2.2 ilvC的定点突变

将ilvC从MH-1000菌株基因组中PCR扩增，对照本基因序列中氨基酸表达偏好性设计定点突变碱基(核苷酸5′-TCCCAGAACCTCCGCGATTCTGGCGTTGAGGTTGTCATT GGTCTGCG-3′)，用重叠延伸PCR方法定点突变成5′-GGCCAGAACCTCCGCGATTCT GGCGTTGAGGTTGTCA TTGGTGAGTT-3′，即氨基酸替换为Ser34Gly，Leu48Glu和Arg49Phe.这样ilvC编码酶的辅酶从NADPH变为NADH，获得ilvC′，如图3所示.

2.3 ilvBN′C′基因片段的拼接验证

以质粒pXMJ19-ilvBN′C′为模板，pX-F，pX-R为引物进行PCR验证，如图4所示，获得的条带3.5 kb(泳道2：基因大小3 610 bp)左右.质粒pXMJ19-ilvBN′C′经Hind III和EcoR I双酶切，理论获得3 610 bp和6 551 bp的条带，分别为ilvBN′C′和pXMJ19质粒片段(图4)，获得条带分别与所述相符.使用纯化的ilvBN′C′的PCR产物测序，获得序列除了碱基突变之外，与ATCC14067序列一致，用Vector NTI 11软件绘制质粒pXMJ19-ilvBN′C′图谱，如图5所示.

图3 ilvC基因定点突变位点及其上下游序列测序图谱Fig.3 Site-directed mutation of ilvC and related sequences

图4 质粒pXMJ19-ilvBN′C′的PCR及酶切验证Fig.4 Validation of pXMJ19-ilvBN′C′ through PCR and endonuclease digestion

图5 构建的pXMJ19-ilvBN′C′质粒图谱Fig.5 Plasmid profile of pXMJ19-ilvBN′C′

2.4 基因工程菌的产L-缬氨酸情况

将已构建的pXMJ19-ilvBN′和pXMJ19-ilvBN′C′分别转化至MH-1000后，获得MH-1031和MH-1032，通过20 mL/500 mL三角烧瓶和50 L发酵罐验证3 批次，发酵时间72 h，往复式摇床振幅5 cm，170 r/min，50 L发酵OD和L-缬氨酸见图6.

摇瓶发酵初始产酸16.7 g/L，MH-1031产L-缬氨酸18.2 g/L，比出发菌增长9.0%，MH-1032产L-缬氨酸19.5 g/L，比出发菌增长16.8%，比MH-1031增长7.1%；

50 L发酵罐发酵测试显示(图6)：MH-1031/pXMJ19-ilvBN′，MH-1032/pXMJ19-ilvBN′C′生长比MH-1000缓慢，是由于高表达质粒所致；发酵过程葡萄糖控制1～2 g/L(曲线未给出)；出发菌MH-1000经72 h发酵产L-缬氨酸35.2 g/L，MH-1031经72 h产37.3 g/L，比出发菌增长6.0%，MH-1032经72 h产L-缬氨酸38.4 g/L，比出发菌高9.1%，比MH-1031高2.9%(表3).

图6 分批发酵OD和产酸曲线Fig.6 The curve of OD and L-val in batch of fermentation

菌株/质粒L⁃缬氨酸(摇瓶)质量浓度/(g·L-1)增长率/%L⁃缬氨酸(50L罐)质量浓度/(g·L-1)增长率/%50L发酵糖酸转化率/%出发菌MH⁃100016．735．221．7MH⁃1031/pXMJ19⁃ilvBN′18．29．037．36．023．3MH⁃1032/pXMJ19⁃ilvBN′C′19．516．838．49．125．8

3 结 论

50 L分批补料发酵结果显示：出发菌株MH-1000 72 h产L-缬氨酸35.2 g/L，MH-1032 72 h产L-缬氨酸38.4 g/L，比出发菌株增长9.1%.对L-缬氨酸代谢通路的ilvBN，将AHAS小亚基别构中心的3 个氨基酸定点突变为Gly20Asp，Ile21 Asp和Ile22 Phe，能够完全解除3 种支链氨基酸对AHAS的反馈抑制作用[7].一分子葡萄糖通过EMP途径产生两分子丙酮酸作为合成L-缬氨酸的底物，而一分子葡萄糖通过HMP途径，通过多种酶作用，脱掉一分子碳生成五碳糖，产生的丙酮酸少于EMP途径.EMP途径甘油醛-3-磷酸脱氢酶的辅酶为NADH，HMP途径的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的辅酶为NADPH.NADH辅酶的序列特征是GXGXXGXXXG(X代表一种氨基酸)，而NADPH辅酶序列特征是GXGXXAXXXA，改变ilvC的氨基酸序列为Ser34Gly，Leu48Glu和Arg49Phe[1]，AHAIR能够利用NADH作为辅酶代替NADPH，通过降低对NADPH的依赖以降低戊糖磷酸途径的物料消耗，相对较高浓度的NADH有助于反应向终产物L-缬氨酸方向进行，进而增加L-缬氨酸产量.

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Site-directedmutagenesisofilvBNandilvCinBrevibacteriumflavumforimprovedproductionofL-valine

GONG Weibo, WANG Hailei, CHENG Guoping, ZHAO Jinjin

(MeiHua Biotech(Langfang) Co., Ltd., Langfang 065001, China)

Brevibacteriumflavum1000 was used as the original strain and site-specific mutagenesis was performed in itsilvBNgene, resulting in an anti-feedback inhibition geneilvBN′. The geneilvC′ encoding acetohydroxyacid isomeroreductase was obtained by site-directed mutagenesis fromilvC. The geneilvBN′C′ was obtained by overlap extension PCR fromilvBN′ andilvC, and then inserted intoE.coli-B.flavumshuttle expression vector pXMJ19 to construct a recombinant plasmid pXMJ19-ilvBN′C′. The recombinant plasmid was subsequently transformed intoB.flavumMH-1000, resulting in the strain MH-1032. The results from fed-batch fermentation experiments in 50 L fermenter indicated that the L-valine productivity of MH-1032 (38.4 g/L) was increased by 9.1% in contrast to that of MH1000 (35.2 g/L) in 72 hours, and the conversion of glucose to L-val increased from 21.7% to 25.8%.

L-valine;Brevibacteriumflavum; acetohydroxyacid synthase; acetohydroxyacid isomeroreductase

2017-08-02

宫卫波(1979—)，男，河北邯郸人，硕士，研究方向为生物化学与分子生物学，E-mail:gongweibo@meihuagrp.com.

TQ922

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1674-2214(2017)04-0228-05

朱小惠)