玉米浆和表面活性剂添加对α-酮戊二酸发酵的影响

，，，,，

(1.莲花健康产业集团股份有限公司 博士后科研工作站，河南 项城 466200；2.天津科技大学 生物工程学院， 天津 300457；3.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457)

玉米浆和表面活性剂添加对α-酮戊二酸发酵的影响

韩洪军1，高立栋1，张顺棠1，李燕军1,2,3，陈宁2,3

(1.莲花健康产业集团股份有限公司 博士后科研工作站，河南 项城 466200；2.天津科技大学 生物工程学院， 天津 300457；3.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457)

首先研究了添加玉米浆和表面活性剂吐温对谷氨酸棒状杆菌GKGD发酵生产α-酮戊二酸的影响.在此基础上，通过采用添加过量玉米浆，同时在产酸期添加吐温60的培养方法，显著提高了α-酮戊二酸的产量.结果表明：相比于吐温80，吐温60更有利于α-酮戊二酸的分泌；在初始发酵培养基中添加6 mL/L玉米浆，在发酵10 h加入1 mL/L吐温60，可以使α-酮戊二酸的质量浓度达到17.9 g/L.

谷氨酸棒杆菌；α-酮戊二酸；玉米浆；表面活性剂

α-酮戊二酸作为三羧酸循环的重要中间代谢物，连接着细胞内的碳氮代谢.同时其本身也是一种多功能的有机酸，在医药、食品和化工领域具有广泛的用途[1-2].α-酮戊二酸可以通过化学法和微生物发酵法合成，目前化学法占主导地位[3].然而，化学合成法多以氰化物为底物，存在产生有毒副产物、反应路线长和需要催化剂等缺点.相比之下，微生物发酵法清洁环保，发展潜力巨大[4].目前研究者们多以解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)来发酵生产α-酮戊二酸[5-6]，然而其发酵周期长、副产物多.由于α-酮戊二酸是谷氨酸生物合成的直接前体，本研究团队在前期工作中从谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌GKG-047出发，敲除谷氨酸脱氢酶1和2，通过双阶段pH和生物素控制策略实现了谷氨酸棒杆菌高产α-酮戊二酸，且生产强度为目前报道最高[7].后续，笔者团队研究了强化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶[8]和减少代谢副产物[9]对α-酮戊二酸积累的影响.

α-酮戊二酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌GKGD为生物素缺陷型.生物素是脂肪酸合成所需的辅酶，是细胞正常生长所必需的，其限量供应会影响脂肪酸的合成和细胞膜的通透性[7].因此，谷氨酸和α-酮戊二酸发酵过程采取生物素亚适量的工艺，既能满足发酵前期菌体必要的生长，又在大量产酸期保证细胞高通透性和产物分泌.然而，这种发酵工艺菌体生物量往往不会太高，笔者尝试采用高生物素促进菌体生长，以及添加表面活性剂促进产物分泌的发酵新工艺.课题组前期研究表明：玉米浆中含有高质量浓度的生物素(约6 μg/mL)，既可以为菌体生长提供丰富的有机氮源，又调控着细胞的转型和产物的分泌.当玉米浆添加浓度过高时，菌体大量繁殖而细胞不能转型，产酸水平很低.吐温作为一种常见的表面活性剂，在发酵过程中添加吐温，可以改变细胞膜的通透性.通过摇瓶发酵分别研究玉米浆和吐温添加浓度对α-酮戊二酸产量的影响，旨在探究新的α-酮戊二酸发酵控制工艺，即通过添加高生物素促进菌体生物量积累，同时添加吐温增加细胞通透性以解决细胞不能转型的问题.

1 材料与方法

1.1 菌 株

α-酮戊二酸生产菌谷氨酸棒杆菌GKGD，保藏于天津科技大学代谢工程研究室.

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨4 g/L，玉米浆5 mL/L，谷氨酸钠2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，琼脂25 g/L.pH 7.0～7.2，0.1 MPa灭菌20 min.

1.2.2 种子培养基

葡萄糖20 g/L，玉米浆20 mL/L，KH2PO43 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，MnSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，尿素5 g/L，pH 7.0～7.2，0.1 MPa灭菌20 min.

1.2.3 发酵培养基

葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，KH2PO41.2 g/L，味精10 g/L，玉米浆3 mL/L，酵母粉5 g/L，消泡剂1 滴，pH 7.0～7.2，0.1 MPa灭菌15 min.

1.3 主要仪器

生化培养箱，广东省医疗器械厂；振荡培养箱，上海智诚分析仪器制造有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SBA-40C生物传感仪，山东省科学院；高效液相色谱仪，日本岛津公司.

1.4 培养方法

1.4.1 菌种活化

取斜面保藏菌种划线接种于活化斜面培养基，32 ℃恒温静置培养10～14 h.

1.4.2 种子培养

用接种针取一环生长良好的活化斜面种子，转接入装有30 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，9 层纱布封口，置于旋转式摇床上，200 r/min，32 ℃振荡培养8 h.

1.4.3 发酵培养

按照体积分数10%接种量，将培养8 h的种子液接种于含有20 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，9 层纱布封口，置于旋转式摇床上，200 r/min，32 ℃振荡培养32 h.

1.5 分析方法

1.5.1 pH测定

采用pH 6.4～8.0精密pH试纸测定.

1.5.2 菌体OD测定

取发酵液用蒸馏水稀释20 倍，采用752型分光光度计测定600 nm波长下的吸光度.

1.5.3 残糖测定

采用SBA-40C生物传感仪测定.

1.5.4 α-酮戊二酸产量测定

发酵液13 000 r/min离心2 min，取上清液稀释100 倍，利用高效液相色谱法测定α-酮戊二酸含量.色谱条件：色谱柱为伯乐Aminex HPX-87H，流动相为5 mmol/L的硫酸，流速0.5 mL/min，柱温30 ℃，检测波长215 nm，进样量20 μL.

2 结果与讨论

2.1 玉米浆添加对α-酮戊二酸发酵的影响

玉米浆是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，含有丰富的氨基酸、核酸、维生素和无机盐等，其中生物素对谷氨酸棒杆菌GKGD产α-酮戊二酸尤为重要.生物素作为菌体细胞膜合成的必要元素，能够调节细胞膜的通透性，同时也是羧化酶系等关键酶的辅酶，对细胞中心代谢具有重要的调控作用.GKGD来源于生物素亚适量型谷氨酸生产菌GKG-047，α-酮戊二酸作为合成谷氨酸的直接前体，生物素含量在其发酵过程中也起着重要的调控作用[7].笔者在发酵培养基中分别添加1，3，5，7，9 mL/L的玉米浆，菌体生物量和α-酮戊二酸的质量浓度如图1所示.

柱状—α-酮戊二酸；曲线—OD600图1 玉米浆对菌体生长和α-酮戊二酸质量浓度的影响 Fig.1 Effects of corn steep liquor addition on bacterial growth and α-ketoglutarate production

从图1可知：当玉米浆添加量较少时，α-酮戊二酸质量浓度随着玉米浆添加量的增加而显著提高，当玉米浆添加量为3 mL/L时，α-酮戊二酸的积累量达到最大值.然而，当玉米浆添加量继续升高时，α-酮戊二酸质量浓度逐渐降低.玉米浆中所含有的生物素是菌体生长以及α-酮戊二酸积累的关键因素.玉米浆添加量不足时，导致菌体量过少，从而使得产酸严重下降；若添加玉米浆过量，则导致菌体生长过盛，能量代谢流向细胞生长，而不利于产酸.所以添加适量的玉米浆，对于菌体的生长以及酮戊二酸的代谢积累至关重要.综上所述，玉米浆的最适添加体积分数为3 mL/L，此时α-酮戊二酸质量浓度为12.1 g/L.

2.2 表面活性剂添加对α-酮戊二酸发酵的影响

吐温(或聚山梨酯)为非离子型表面活性剂，可以改善细胞的通透性，改善细胞与氧的接触，从而促进酶和代谢产物的分泌与生产.但吐温添加时间过早不利于菌体的生长，所以将吐温的添加时间确定为菌体生长的稳定期(发酵10 h以后)，既能确保发酵过程中具有一定的菌体量，同时又可以增强细胞将α-酮戊二酸分泌到胞外的能力.笔者比较研究了两种表面活性剂(吐温60、吐温80)促进菌体分泌α-酮戊二酸的作用.两种表面活性剂在发酵培养基中的添加体积分数分别为0.5，1，2，5 mL/L，α-酮戊二酸的产量如图2所示.

图2 表面活性剂吐温60/吐温80对α-酮戊二酸质量浓度的影响 Fig.2 Effects of surfactants (Tween 60/Tween 80) addition on α-ketoglutarate production

由图2可知：吐温80和吐温60虽然都是表面活性剂，但对于膜透性的作用却有明显区别，在添加量为0.5，1，2 mL/L时，吐温60对于菌体分泌α-酮戊二酸的效果更加明显.当吐温60添加量为1 mL/L时，α-酮戊二酸的质量浓度最高，达到11.7 g/L.

2.3 玉米浆和表面活性剂的复合添加对α-酮戊二酸发酵的影响

玉米浆会影响发酵过程中菌体量的多少和代谢流的分配，在菌体生长稳定期加入表面活性剂可以增强细胞分泌α-酮戊二酸的能力.因此，为了达到通过增加菌体量来提高α-酮戊二酸产量的目的，在发酵过程中添加玉米浆，同时在稳定期加入吐温60来促进α-酮戊二酸的分泌.在初始发酵培养基中添加不同体积分数玉米浆，在发酵10 h时添加不同体积分数的吐温60.以添加3 mL/L玉米浆、1 mL/L吐温60为对照，在玉米浆添加量为6 mL/L和9 mL/L时，均分别添加1 mL/L和2 mL/L的吐温60，α-酮戊二酸的产量如图3所示.

从图3可知：当采取上述单独优化确定的最适体积分数的玉米浆(3 mL/L)和吐温60(1 mL/L)组合时，α-酮戊二酸的质量浓度为12.8 g/L，略微高于单独添加实验的最高值；当添加6 mL/L玉米浆，且添加吐温60时，α-酮戊二酸积累量显著提高，吐温60添加量为1 mL/L时，α-酮戊二酸质量浓度达到最高值(17.9 g/L)；然而，当玉米浆添加体积分数提高到9 mL/L时，且添加1 mL/L或2 mL/L吐温60，α-酮戊二酸产量提高不明显.因此，采用添加过量玉米浆，同时添加适量吐温60的培养方式，可以有效提高产物的积累和分泌.

1—玉米浆3 mL/L，吐温 60 1 mL/L；2—玉米浆6 mL/L，吐温60 1 mL/L；3—玉米浆6 mL/L，吐温60 2 mL/L；4—玉米浆9 mL/L，吐温60 1 mL/L；5—玉米浆 9 mL/L，吐温60 2 mL/L 图3 玉米浆和吐温60复合添加对α-酮戊二酸质量浓度的影响 Fig.3 Combinational addition of corn steep liquor and Tween 60 on α-ketoglutarate production

3 结 论

在谷氨酸棒状杆菌发酵产α-酮戊二酸的过程中，玉米浆的添加量对α-酮戊二酸生产至关重要，在稳定期添加一定量的吐温60能够促进α-酮戊二酸的分泌.通过添加过量玉米浆以促进菌体生长，同时在稳定期(产酸期)添加适量吐温60，可以

有效提高α-酮戊二酸的产量.最终确定发酵培养基中玉米浆的添加量为6 mL/L，在发酵开始10 h后加入1 mL/L的吐温60，α-酮戊二酸的质量浓度达到最高值17.9 g/L.

[1] SAUER M, PORRO D, MATTANOVICH D, et al. Microbial production of organic acids: expanding the markets[J]. Trends in biotechnology, 2008,26(2):100-108.

[2] OTTO C, YOVKOVA V, BARTH G. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2011,92(4):689-695.

[3] STOTTMEISTER U, AURICH A, WILDE H, et al. White biotechnology for green chemistry: fermentative 2-oxocarboxylic acids as novel building blocks for subsequent chemical syntheses[J]. Journal of industrial microbiology and biotechnology, 2005,32(11/12):651-664.

[4] FINOGENOVA T V, MORGUNOV I G, KAMZOLOVA S V, et al. Organic acid production by the yeastYarrowialipolytica: a review of prospects[J]. Applied biochemistry and microbiology, 2005,41(5):418-425.

[5] ZHOU J W, YIN X X, MADZAK C, et al. Enhanced α-ketoglutarate production inYarrowialipolyticaWSH-Z06 by alteration of the acetyl-CoA metabolism[J]. Journal of biotechnology, 2012,161(3):257-264.

[6] GUO H W, MADZAK C, DU G C, et al. Effects of pyruvate dehydrogenase subunits overexpression on the α-ketoglutarate production inYarrowialipolyticaWSH-Z06[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2014,98(16):7003-7012.

[7] LI Y J, SUN L C, FENG J, et al. Efficient production of α-ketoglutarate in thegdhdeletedCorynebacteriumglutamicumby novel double-phase pH and biotin control strategy[J]. Bioprocess and biosystems engineering, 2016,39(6):967-976.

[8] 孙兰超,刘涛,赵岩,等.增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性对谷氨酸棒状杆菌积累α-酮戊二酸的影响[J].现代食品科技,2016,32(6):63-69.

[9] 赵岩,黄龙辉,李娟,等.谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响[J].发酵科技通讯,2016,45(4):215-219.

Influenceoftheadditionofcornsteepliquorandsurfactantsonfermentativeproductionofα-ketoglutarate

HAN Hongjun1, GAO Lidong1, ZHANG Shuntang1, LI Yanjun1,2,3, CHEN Ning2,3

(1.Post-Doctoral Research Center, Lotus Health Group Co., Ltd., Xiangcheng 466200, China; 2.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 3.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China)

In this study, the influence of corn steep liquor and surfactants addition on fermentative production of α-ketoglutarate byCorynebacteriumglutamicumGKGD was investigated. The production of α-ketoglutarate was significantly improved by adding corn steep liquor in the initial fermentation medium and adding appropriate amount of Tween 60 at the beginning of acid-producing phase. The results indicated that Tween 60 was more effective in promoting the secretion of α-ketoglutarate than Tween 80. The α-ketoglutarate production achieved the highest value of 17.9 g/L with 6 mL/L of corn steep liquor and 1 mL/L of Tween 60 added.

Corynebacteriumglutamicum; α-ketoglutarate; corn steep liquor; surfactant

2017-09-01

中国博士后科学基金资助项目(2016M601269)

韩洪军(1966—)，男，河南沈丘人，高级工程师，研究方向为发酵工程和农产品深加工，E-mail：lhhhj5539@163.com.

TQ92

A

1674-2214(2017)04-0216-04

朱小惠)