L-异亮氨酸高效液相色谱检测方法的研究

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(1.梅花生物科技集团股份有限公司，河北 廊坊 065001；2.廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北 廊坊 065001)

L-异亮氨酸高效液相色谱检测方法的研究

唐艳1，李晶1，吴涛2

(1.梅花生物科技集团股份有限公司，河北 廊坊 065001；2.廊坊梅花生物技术开发有限公司，河北 廊坊 065001)

L-异亮氨酸在紫外光区无吸收峰，需将其进行衍生后才能测定.通过对比两种柱前衍生方法，建立高效液相色谱法柱前衍生检测L-异亮氨酸质量分数的方法.OPA自动衍生法检测耗时15 min，R=1，加标回收率99%～100.1%，RSD<1.0%；PITC手动衍生法检测耗时30 min，加标回收率96%～98%，RSD<1%.OPA自动衍生法在检测的时效性和准确性方面均具有明显优势，可用来高效地检测L-异亮氨酸的质量分数，在生物发酵、饲料添加剂、食品添加剂和制药等领域具有较高的应用价值.

异亮氨酸；高效液相色谱；OPA；自动衍生；手动衍生

L-异亮氨酸(L-isoleucine)是人体必需氨基酸，是支链氨基酸的重要一员，具有促进体内蛋白质、酶和肽类激素合成等功能，在肌肉蛋白代谢中尤为重要[1]，主要用于治疗神经障碍、食欲减退和贫血等，有增强机体免疫力的功能，是氨基酸输液、氨基酸口服剂不可缺少的组分[2].此外，L-异亮氨酸被广泛运用于食品工业、化妆品、光化学和电化学等领域[3-4].L-异亮氨酸主要通过发酵法生产[5]，在生产中准确、高效地检测L-异亮氨酸质量分数显得至关重要.目前，介绍L-异亮氨酸测定方法的文献较少，采用纸层析法[6]、化学比色法[7]测定L-异亮氨酸准确度低，使用氨基酸分析仪测定成本较高[8]，不适用于生产测定.笔者对比了两种柱前衍生方法，建立了一种高效液相色谱法柱前衍生检测L-异亮氨酸质量分数的方法.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

高效液相色谱仪(Agilent technologies 1200)，Mili-Q超纯水机(元原科贸)，电子天平(精度±0.000 1 g)(梅特勒-托利多)，真空泵磁力搅拌器、pH计FE20(梅特勒-托利多).

1.1.2 主要试剂

二水合磷酸二氢钠(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，邻苯二甲醛试剂(OPA)，硼酸缓冲液(安捷伦公司)，L-异亮氨酸标准物质(Sigma公司)，三乙胺、异硫氰酸苯酯(PITC)，蛋氨酸(生化试剂)，乙酸钠(色谱纯).

1.2 溶液的配制

1.2.1 OPA自动衍生法

流动相A：称取6.24 g二水合磷酸二氢钠，转移到1 000 mL玻璃烧杯中，加入1 000 mL超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解，用氢氧化钠调节溶液pH值至7.80.

流动相B：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10.

1.2.2 PITC手动衍生法

三乙胺乙腈溶液(1 mol/L)：取三乙胺695 μL，加乙腈4.30 mL.

异硫氰酸苯酯乙腈溶液(1 mol/L)：取60 μL PITC，加乙腈4.94 mL.

流动相A：V(乙腈)∶V(水)=80∶20.

流动相B：乙酸钠水溶液50 mmol/L.

1.3 样品处理

1.3.1 OPA自动衍生法

准确称取样品0.100 0 g，用蒸馏水定容至200 mL，备用.

准确称取L-异亮氨酸标准物质0.100 0 g，用蒸馏水定容至100 mL，稀释成不同质量浓度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L).

1.3.2 PITC手动衍生法

内标物溶液制备：准确称取蛋氨酸0.400 0 g于100 mL容量瓶中，加水溶解，定容，备用.

对照品溶液制备：称取L-异亮氨酸适量，加水溶解，配制质量浓度为1 mg/mL的溶液.移取5 mL L-异亮氨酸标准物质溶液和2 mL内标物溶液，加水20 mL，混匀，备用.

样品溶液制备：称取1 g异亮氨酸成品于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容.移取5 mL样品溶液和2 mL内标物溶液，加水20 mL，混匀，备用.

1.4 色谱条件

1.4.1 OPA自动衍生色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron，柱温40 ℃，检测波长338 nm，进样量0.5 μL，流动相A为磷酸二氢钠溶液，流动相B为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10，流速为2 mL/min；梯度洗脱：0～1 min，0% B；1～9.8 min，57% B；9.8～10 min，100% B；10～12 min，100% B.

1.4.2 PITC手动衍生色谱条件:

色谱柱：Hypersil 5 AA-ODS 200 mm×2.1 mm，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm，进样量3 μL.梯度洗脱条件：φ(流动相A)∶φ(流动相B)=24%∶76%，保持20 min；φ(流动相A)∶φ(流动相B)=10%∶90%，保持10 min.

1.5 操作步骤

1.5.1 OPA自动衍生法

将样品和标品稀释液过膜上机，自动衍生化反应，吸取硼酸缓冲液2.5 μL，样品0.5 μL，OPA 0.5 μL，混合空气3 μL，最大速度混合5 次，再吸取水32 μL，混合空气18 μL，最大速度混合2 次，注入色谱柱，进行色谱分析.

1.5.2 PITC手动衍生法

吸取对照品溶液及样品溶液各300 μL，分别置于1.5 mL离心管中，向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液150 μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液150 μL，混匀，室温放置1 h，然后加入正己烷600 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，用0.22 μm水相针式过滤器过滤.

待液相色谱稳定后，取上述溶液进行色谱分析.

2 结果与讨论

2.1 OPA自动衍生法

2.1.1 进样量的选择

采用0.2，0.5，1.0，1.5 μL进样量进行衍生化反应，其中0.5 μL反应完全，平行测定样品RSD<1%，其他三种RSD>2%.综合考虑反应程度、结果精密度和准确度，确定进样量为0.5 μL.

2.1.2 检测波长的选择

用紫外检测器测定异亮氨酸质量分数，在波长338 nm有最大吸收峰，基线稳定，灵敏度高，在<262 nm处无峰.综合考虑待测组分最大吸收波长、灵敏度、分离度、基线稳定性，最终确定检测波长为338 nm.

利用自动衍生方法，对不同质量浓度的标品(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L)进行色谱分析，出峰谱图见图1，X轴为标品浓度，Y轴为峰面积，出峰时间为7.5 min.制作标准曲线见图2，线性方程为Y=1 445.024 4X-2.090 2，相关系数R2=1.

图1 样品出峰谱图Fig.1 Chromatogram of the sample

图2 自动衍生法标准曲线图Fig.2 Automatic derivation of L-isoleucine standard curve

按本测定方法所确定的实验条件，对L-异亮氨酸标准品作质量分数验证，测定样品加标回收率，确保检测系统无影响，质量分数为99.5%的标准品，检测结果为99.2%，样品检测RSD<2%，加标回收率>99%，此方法准确度高、结果可靠.具体检测结果见表1.

表1 样品检测结果和回收率Table 1 Determination results and recovery of samples

2.2 PITC手动衍生法

采用手动衍生方法测定L-异亮氨酸质量分数，蛋氨酸与异亮氨酸分离度高且稳定.选用蛋氨酸作为内标物质，采用加内标物质计算样品质量分数，排除系统进样量不精确导致的结果不准确.蛋氨酸出峰时间为10.5 min，L-异亮氨酸出峰时间为14.8 min，具体谱图见图3.

图3 L-异亮氨酸样品色谱图Fig.3 Chromatogram of L-isoleucine sample

采用加内标物蛋氨酸来计算结果：加标回收率为96%～98%，RSD<2%，检测结果见表2.

表2 样品检测结果和回收率Table 2 Determination results and recovery of the samples

3 结 论

通过上述结果可以得出：与PITC手动衍生法相比，采用OPA自动衍生法操作简单，引入人为误差小，检测耗时短，加标回收率高，检测结果更可靠.笔者建立的OPA自动衍生高效液相色谱法可准确、高效地检测L-异亮氨酸质量分数.

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StudyonL-isoleucineanalysisbyhighperformanceliquidchromatography

TANG Yan1, LI Jing1, WU Tao2

(1.Meihua Holdings Group, Langfang 065001, China; 2.Meihua Biotech (Langfang) Co., Ltd., Langfang 065001, China)

L-Isoleucine has no absorption in the ultraviolet (UV) region and needs to be derivatized before determination by UV detector. The aim of this work is to compare the two pre-column derivatization methods: OPA automatic derivatization and PITC manual derivatization, and establish an efficient method for the determination of L-isoleucine content by high performance liquid chromatography. The total detection time with OPA automatic derivatization method took 15 minutes withR-value of 1, and the recoveries were from 99% to 100.1% with RSD<1%. The PITC manual derivatization took 30 min, with the recovery rate of 96% to 98% (RSD<1%). OPA automatic derivatization exhibited obvious advantages in the detection timeliness and accuracy, which can be used to efficiently detect L-isoleucine content. It has high application value in microbial fermentation, feed additives, food additives and pharmaceuticals.

L-isoleucine; HPLC; OPA; automatic derivatization; manual derivatization

2017-08-10

河北省氨基酸工程技术研究中心创新平台建设资助项目(131000021)

唐 艳(1987—)，女，内蒙古通辽人，助理工程师，研究方向为氨基酸分析检测，E-mail：1041647978@qq.com.

O657.72

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1674-2214(2017)04-0220-04

朱小惠)