几种色素抑制过氧亚硝酸根损伤酪氨酸能力的对比

张辰暘，魏安琪，王 妍，谢子奇，罗云敬

(北京工业大学生命科学与生物工程学院，中国 北京 100124)

几种色素抑制过氧亚硝酸根损伤酪氨酸能力的对比

张辰暘，魏安琪，王 妍，谢子奇，罗云敬

(北京工业大学生命科学与生物工程学院，中国 北京 100124)

过氧亚硝酸根可以通过强氧化性及强硝化性损伤酪氨酸，从而损害人体健康.姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素具有抗氧化、抗硝化性，但其自身颜色在研究酪氨酸硝化损伤的常规方法中易造成干扰.为测定色素抑制3-硝基酪氨酸生成的能力，使用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-PDAD, High Performance Liquid Chromatography-Photodiode Array Detector)法对硝化损伤体系成分进行分离，使用荧光光谱法测定色素抑制酪氨酸二聚体生成能力，邻苯三酚自氧化法测定超氧根阴离子抑制能力.结果表明3-硝基酪氨酸抑制率从大到小为姜黄素、原花青素、柚皮素、槲皮素、VC；酪氨酸二聚体抑制率从大到小为原花青素、姜黄素、柚皮素、槲皮素、VC；邻苯三酚自氧化抑制率从大到小为姜黄素、槲皮素、柚皮素、VC，原花青素无明显影响.分析表明4种色素成分抗氧化、抗硝化能力与其结构密切相关.

高效液相色谱-二极管阵列检测器；荧光光谱法；过氧亚硝酸根；酪氨酸损伤；黄酮类色素

近年来食品工业高度发达，食用色素的使用十分广泛，研究表明黄酮类、多酚类天然食用色素具有良好的抗氧化功能[5-10]，张迪[11]、赵静[12]等验证了原花青素、槲皮素与柚皮苷的抗氧化能力，鲁吉珂[13]、周丽娟[14]、周舒文[15]等研究了姜黄素抗氧化、清除自由基的能力，但对于食用色素成分抑制过氧亚硝酸根损伤酪氨酸的能力的研究报道较少.由于色素成分自身颜色在常规紫外分光光度法中易造成干扰，并且自由基损伤酪氨酸实验体系成分较为复杂，本文利用高效液相色谱法对体系成分进行分离，研究对比姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素抑制过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的能力；使用荧光光谱法探究4种色素抑制过氧亚硝酸根氧化损伤酪氨酸的能力，并使用邻苯三酚自氧化法探究其抗氧化机理，实验使用维生素C(VC)作为阳性对照.

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，SunFireRMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱(美国Waters公司)，U-3010紫外-可见分光光度计(日本日立公司)，SH-3数显恒温磁力搅拌器(北京金紫光科技发展有限公司)，KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)，PHS-25数显酸度计(上海精密科学仪器公司)，DKB-450A电热恒温水槽(上海森信试验仪器有限公司)，BS-210S电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，PR020XXM1纯水机(北京PALL纯水公司)，DL-300掌上离心机(北京鼎国生物公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(上海科升仪器有限公司),F-4500荧光分光光度计(日本日立公司).

亚硝酸异戊酯购于国药集团化学试剂有限公司，正己烷(色谱纯)、过氧化氢(30%)、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、维生素C、焦性没食子酸和无水乙醇购于天津市福晨化学试剂厂，二氧化锰、氢氧化钠、亚硫酸氢钠和盐酸购于北京化工厂，L-酪氨酸、L-3-硝基酪氨酸、甲醇(色谱纯)、姜黄素、槲皮素、柚皮素购于上海安谱科学仪器有限公司，三羟甲基氨基甲烷、氯化血红素购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，原花青素购于北京普天同创生物科技有限公司.试剂除标注外均为分析纯，实验用水均为二次去离子水.姜黄素、槲皮素、柚皮素使用无水乙醇配置为1×10-3mol/L的储备液，原花青素、VC使用去离子水配置为1×10-3mol/L的储备液.

1.2 过氧亚硝酸根溶液的制备

过氧亚硝酸根溶液使用UPPU与PRYOR的方法制备[16]，由过氧化氢与亚硝酸异戊酯发生取代反应生成，使用前用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液稀释，使用紫外-可见分光光度计测定过氧亚硝酸根浓度.

1.3 HPLC法对几种色素抑制过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的研究

1.3.1 3-硝基酪氨酸标准曲线的制作 准确称取3-硝基酪氨酸标准品11.3 mg，使用0.05 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)定容至50 mL，然后分别稀释至10，50，100，200，500和1 000 μmol/L.分别取上述溶液1 mL过0.22 nm有机相微孔滤膜进液相进行检测，以3-硝基酪氨酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.色谱条件：色谱柱选择SunFireRMC18反相色谱柱，其规格为4.6 mm×150 mm，粒径5 μm.流动相V(甲醇)∶V(PBS)=1∶9(pH=7.4)，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温37 ℃，检测波长420 nm.

1.3.2 姜黄素等对过氧亚硝酸根诱导的3-NT生成的影响 在棕色EP管中加入1.5 mL浓度为1 mmol/L的酪氨酸溶液，随后加入不同体积的浓度为1×10-3mol/L的姜黄素溶液，使其终浓度分别为0，3.3，10.0，16.6，23.3，33.3，50.0和66.6 mmol/L，使用PBS溶液补齐至2.8 mL，混合物于37 ℃水浴孵育5 min后加入200 mmol/L的ONOO-溶液，于37 ℃水浴搅拌反应6 h.原花青素、槲皮素、柚皮素和维生素C实验组做相同处理.色谱条件同1.3.1.

1.4 荧光法对几种天然色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化的抑制作用研究

1.4.1 二聚体-过氧亚硝酸根标准曲线 在生理条件下(pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液，37 ℃)，酪氨酸浓度为1.0×10-3mol/L，氯化血红素1.0×10-6mol/L，只改变ONOO-的浓度(浓度范围为1.0×10-6～2.0×10-3mol/L)，制作标准曲线，荧光光谱仪主要参数：扫描模式Emission，数据模式Fluorescence，激发波长317 nm，发射波长范围350～500 nm，扫描速度1 200 nm/min.

1.4.2 姜黄素等对过氧亚硝酸根诱导的酪氨酸二聚体生成的影响 在10 mL塑料离心管中分别加入500 μL酪氨酸(1.0×10-3mol/L)，50 μL氯化血红素(1.0×10-6mol/L)，不同体积的姜黄素(1.0×10-3mol/L)，使用Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)补齐体积至4 950 μL，以无水乙醇作为空白对照，最后加入50 μL的ONOO-溶液启动反应(ONOO-的浓度每次通过紫外分光光度计测定其含量，并稀释到1.0×10-2mol/L)，瞬间手持涡旋10 s，随后于37 ℃水浴中反应20 min.反应完成后取3 mL于1 cm比色皿中，测定反应液荧光强度.原花青素、槲皮素、柚皮素和维生素C实验组做相同处理.荧光光谱仪主要参数同1.4.1.

1.5 荧光法测定天然色素对邻苯三酚自氧化反应的抑制作用

取2.80 mL pH=8.2 的Tris-HCl 缓冲液，0.10 mL 三蒸水一同放入一5 mL比色管中，另取0.10 mL 邻苯三酚溶液(60 mmol/L)放入另一5 mL比色管中，将两比色管同时放入25 ℃水浴中保温20 min.随后，将两比色管中溶液迅速混合后快速摇匀，静置30 s后于1 cm比色皿中放入荧光光谱仪检测，记录激发波长446 nm、发射波长502 nm光谱条件下的荧光动力学曲线.该曲线0～5 min 部分的斜率为V0.将0.10 mL 水换为不同浓度的姜黄素溶液，荧光动力学曲线的斜率为Vs.添加原花青素、槲皮素、柚皮素及维生素C实验组按照上述实验条件做同样处理.荧光光谱主要参数：扫描模式Time，数据模式Fluorescence，激发波长446 nm，发射波长502 nm.

2 结果与讨论

2.1 几种色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的抑制作用

2.1.1 3-NT标准曲线 在本文色谱条件下，3-硝基酪氨酸(3-NT)色谱峰与其他峰明显分开，可以对其进行准确定量.标准曲线y=18.968x-0.158 7，R2=0.999 6，线性关系良好.

2.1.2 几种色素成分对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸硝化的色谱分析

由图1可以看出，在加入姜黄素、原花青素、槲皮素和柚皮素的体系中，酪氨酸硝化损伤产物3-NT的生成量随色素加入量增加而不同程度地降低，并且对比VC下降趋势更加明显.

2.1.3 色素成分对过氧亚硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用 以谱图中对应位置处峰面积参照3-NT标准曲线计算浓度，按式(1)计算天然产物对ONOO-损伤的抑制能力，所得结果见表1.

抑制率=(1-I2/I1)×100%,

(1)

式中：I1为未添加食用色素时ONOO-诱导酪氨酸硝化生成3-NT的浓度;I2为添加食用色素时ONOO-诱导酪氨酸硝化生成3-NT的浓度.

表1 各色素梯度浓度抑制率统计

图1 加入不同体积抑制剂的酪氨酸硝化色谱图(a～e：姜黄素、原花青素、槲皮素、柚皮素、VC，抑制剂A～H的最终浓度: 0，3.3，10.0，16.6，23.3，33.3，50.0,66.6 mmol/L)Fig.1 Chromatography of Tyr induced by ONOO- add with different concentration of inhibitor(The addition of a～f inhibitors: curcumin, proanthocyanidins, quercetin, naringenin, VC. Final concentration of each inhibitor：0.0,3.3,10.0,16.6,23.3,33.3,50.0 and 66.6 mmol/L)

分析发现，在本文浓度范围内姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素对于过氧亚硝酸根引发的酪氨酸硝化损伤均有不同程度的抑制作用，抑制能力从大到小为姜黄素、原花青素、柚皮素、槲皮素、VC.浓度为10 μmol/L时，姜黄素抑制率仍达到72.52%，原花青素为57.56%，槲皮素、柚皮素均在48.5%左右，而同样浓度的VC抑制率仅12.38%，较低浓度的4种色素表现出良好的抗硝化活性.姜黄素分子中具有多个功能基团，如两个苯丙烯酰基骨架、苯环上的酚羟基与甲氧基及丙烯基、β-双酮/烯醇式结构的连接，使其具有良好的抗硝化活性[17].

2.2 几种色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸二聚体生成的抑制

2.2.1 二聚体-过氧亚硝酸根标准曲线 以过氧亚硝酸根浓度为横坐标，二聚体荧光值为纵坐标制作标准曲线，标准曲线y=3.738x+306.8，R2=0.996，线性关系良好.

2.2.2 几种色素对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化的荧光光谱分析 4种色素对于过氧亚硝酸根诱导的酪氨酸氧化均具有不同程度的抑制作用，抑制能力与色素浓度呈正相关(图2)，其中姜黄素作用最为明显，不同浓度姜黄素抑制酪氨酸二聚体生成的荧光光谱见图2(a).

图2 添加姜黄素(a)、原花青素(b)、槲皮素(c)、柚皮素(d)、VC(e)的酪氨酸二聚体荧光光谱图(A-F：0，2.0，6.0，10.0，14.0，20.0 μmol/L)Fig.2 Fluorescence intensity of dimer-tyr induced by ONOO-add with different concentration of: curcumin(a), proanthocyanidins(b), quercetin(c), naringenin(d) and VC(e)(A-F：0.0，2.0，6.0，10.0，14.0，20.0 μmol/L)

2.2.3 色素成分对过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化的抑制作用 以光谱图中λex/em=317/408 nm处的荧光值，参照二聚体-过氧亚硝酸根浓度标准曲线，计算ONOO-浓度，按公式(2)计算天然色素的抑制率，所得结果见表2.

抑制率=(1-I2/I1)×100%，

(2)

式中：I1为未添加天然色素时ONOO-诱导酪氨酸氧化生成酪氨酸二聚体的浓度；I2为添加天然色素时ONOO-诱导酪氨酸氧化生成酪氨酸二聚体的浓度.

表2 天然色素对过氧亚硝酸根氧化酪氨酸的抑制作用

结果表明，姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素对过氧亚硝酸根氧化酪氨酸均具有不同程度的抑制作用.随着几种天然色素的浓度不断增加，酪氨酸二聚体的生成量逐渐减少，抑制作用从大到小为原花青素、姜黄素、柚皮素、槲皮素、维生素C.在低浓度(2 μmol/L)时，4种色素已能够抑制过氧亚硝酸根诱导酪氨酸氧化损伤，姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素的抑制率分别达到了24.03%，50.80%，7.20%及20.99%，而同浓度的维生素C抑制率仅1.30%，其中微量的原花青素表现出良好的抗氧化活性，而槲皮素虽有报道显示其可以抑制ONOO-引起的鲁米诺化学发光反应和硝化反应[18]，但在抑制ONOO-氧化酪氨酸过程中，槲皮素的抗氧化活性不及其他几种天然色素.

2.3 几种色素对邻苯三酚自氧化的抑制作用

图3 天然色素对邻苯三酚自氧化抑制率 Fig.3 Inhibition rate of natural pigment on autoxidation of pyrogallic acid

检测结束后，读取荧光动力学曲线拟合出的反应速率，按公式(3)计算天然色素对邻苯三酚自氧化的抑制能力，以色素浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，见图3.

抑制率=(V0-Vs)/V0×100%,

(3)

式中：V0为未添加天然色素时邻苯三酚自氧化速率;Vs为添加天然色素时邻苯三酚自氧化速率.

结果表明，姜黄素、原花青素、槲皮素及柚皮素对邻苯三酚自氧化过程均具有不同程度的抑制作用.由图可知，随着几种色素的浓度不断增加，邻苯三酚自氧化速率不断降低，当浓度达到300 μmol/L时，姜黄素、槲皮素及柚皮素的抑制率分别为64.66%， 33.60%，19.88%，而同浓度的维生素C抑制率为10.66%，3种色素成分表现出良好的清除超氧根阴离子的能力.原花青素在此实验中未表现出良好的抑制作用，可能由于其以聚合物形式存在，在该体系中其空间结构影响了抗氧化活性[19].

3 结论

由上述试验可知，姜黄素、原花青素、槲皮素、柚皮素均具有良好的抗氧化、抗硝化能力，其中姜黄素的作用最为明显，其苯环上的酚羟基、甲氧基和β-双酮结构能够有效保护生物大分子免于过氧亚硝酸根的氧化、硝化损伤.姜黄素、槲皮素、柚皮素能够通过清除过氧亚硝酸根分解产生的超氧根阴离子实现其抗氧化功能，而原花青素由于其多聚物的存在形式，对超氧根阴离子的抑制效果并不明显.本文对探究食用色素成分在人体内的代谢、保健作用机理具有启示作用.本文分析方法对于成分复杂的食用色素-自由基体系可以进行准确分析，对于未来新型食品添加剂的抗氧化、抗硝化能力分析具有一定指导作用.

[1] GERARDO F, RAFAEL R. Chemical biology of peroxynitrite: kinetics, diffusion, and radicals[J]. ACS Chem Biol, 2009,4(3):161-177.

[2] NOVAK J, SUTTNAR J, CHRASTINOVA L,etal. 3-Nitrotyrosine in sera of patients with myelodysplastic syndromes, a preliminary study[J]. Blood, 2014,124(21):5624.

[3] CHANDRASEKARAN K, SWAMINATHAN K, CHATTERJEE S,etal. Apoptosis in HepG2 cells exposed to high glucose[J]. Toxicol Vitro, 2010,24(2):387-396.

[4] PENNATHUR S, JACKSON-LEWIS V, PRZEDBORSKI S,etal. Mass spectrometric quantification of 3-nitrotyrosine, ortho-tyrosine, and o,o’-dityrosine in brain tissue of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice, a model of oxidative stress in parkinson’s disease[J]. J Biol Chem, 1999,274(1):34621-34628.

[5] 李 旭. 茶多酚的抗自由基作用[J]. 科技视界, 2014(25):352-353.

[6] DIMITRIC J M, BORIS P, MILENKOVIC D,etal. Antiradical activity of delphinidin, pelargonidin and malvin towards hydroxyl and nitric oxide radicals: The energy requirements calculations as a prediction of the possible antiradical mechanisms[J]. Food Chem, 2017,218(1):440-446.

[7] 赵文恩，黄进勇，王文峰,等. 类胡萝卜素与二氧化氮自由基(NO2)的反应[J]. 高等学校化学学报, 2006,27(3):556-558.

[8] ZHANG J, HOU X, HUSSAIN A,etal. Assessment of free radicals scavenging activity of seven natural pigments and protective effects in AAPH-challenged chicken erythrocytes[J]. Food Chem, 2014,145(7):57-65.

[9] 田雪琪,田 凯,陈朝银. 姜黄素类似物的抗氧化活性及其构效关系研究进展[J]. 云南中医学院学报, 2013,36(1):94-97.

[10] 张 欣,赵新淮.几种多酚化合物抗氧化性的不同化学评价及相关性分析[J]. 食品科学, 2008,29(10):85-89.

[11] 张 迪,王剑波,李文凡,等. 槲皮素、虎杖苷和染料木素抗氧化作用 及其对UVB致HaCaT细胞损伤的保护研究[J]. 中华临床医师杂志(电子版), 2013,7(12):5387-5391.

[12] 赵 静,李玉琴,王芳乔,等. 6 种黄酮类化合物清除超氧阴离子自由基能力及其构效关系[J]. 中国医药导报, 2014,11(29):7-14.

[13] 鲁吉珂,郝利民,陶如玉,等. 不同纯度茶多酚和姜黄素的抗氧化活性[J]. 食品科学, 2015,36(17):17-21.

[14] 周丽娟,赵军宁,徐海波,等. 不同商品规格、等级姜黄提取物抗氧化作用比较研究[J]. 中药药理与临床, 2016,32(1):110-112.

[15] 周舒文，徐德锋，杨幸群，等. 脂质体的粒径大小对二甲基姜黄素抗癌能力的影响研究[J]. 常州大学学报(自然科学版), 2016,28(6):14-17.

[16] UPPU R M, PRYOR W P. Synthesis of peroxynitrite in a two-phase system using isoamyl nitrite and hydrogen peroxide[J]. Anal Biochem, 1996,236(2):242-249.

[17] CHARLES R. Emerging role of polyphenolic compounds in the treatment of neurodegenerative diseases: a review of their intracellular targets[J]. Eur J Pharmacol, 2006,545(1):51-64.

[18] 廖力夫,刘传湘,周 昕. 槲皮素和儿茶素对过氧亚硝酸根引发的反应的影响[J]. 数理医药学杂志, 2003,16(1):58-59.

[19] 赵 静,李玉琴,王芳乔,等. 6 种黄酮类化合物清除超氧阴离子自由基能力及其构效关系[J]. 中国医药导报,2014,11(29):7-10.

ComparisonofSeveralPigmentsInhibitPeroxynitriteDamagingTyrosineStudyontheEffectofSeveralPigmentsonTyrosineDamageInducedbyPeroxynitrite

ZHANGChen-yang,WEIAn-qi,WANGYan,XIEZi-qi,LUOYun-jing*

(College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

HPLC-PDAD; fluorescence spectrometry; peroxynitrite; tyrosine damage; flavonoid pigments

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.06.005

2017-04-14

国家科技支撑计划资助项目(2015BAK44B00)

*通讯作者,E-mail：luoyj@bjut.edu.cn

Q55

A

1000-2537(2017)06-0034-06

(编辑 WJ)