调经汤对卵巢早衰模型大鼠卵巢功能影响的实验研究

沈炜 陈学奇

调经汤对卵巢早衰模型大鼠卵巢功能影响的实验研究

沈炜1陈学奇2

目的观察调经汤对卵巢早衰模型大鼠卵巢功能的影响。方法将60只雌性成熟未交配Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性药物对照组、调经汤低、中、高剂量组，每组10只。空白组大鼠按0.4mL/100g体质量腹腔注射无菌注射用水，其余各组大鼠按0.4mL/100g体质量腹腔注射浓度为0.5mg/mL的顺铂溶液，连续7天。观察大鼠行为变化、动情周期，采用放射免疫法检测大鼠血清促卵泡生成素（FSH）、雌激素（E2）和促黄体生成素（LH）水平，光镜观察卵巢组织形态改变。结果模型组和阳性药物对照组大鼠无稳定的动情周期，调经汤中、高剂量组逐渐恢复规律的动情周期。给药后第7、14天，与空白对照组比较，模型组大鼠血清FSH、LH升高，E2降低，差异有统计学意义[第7天：（7.38±0.99）IU/L比（6.18±0.24）IU/L，（3.35±0.27）ng/L比（2.79±0.24）ng/L，（94.04±6.22）ng/L比（109.10±5.69）ng/L，P均＜0.05；第14天：（8.01±0.13）IU/L比（6.97±0.88）IU/L，（4.22±0.82）ng/L比（3.20±0.17）ng/L，（131.74±23.65）ng/L比（157.82±5.68）ng/L，P均＜0.05]；给药后第7天，与模型组比较，调经汤低、中、高剂量组大鼠血清FSH降低，E2升高，差异有统计学意义[（5.72±0.51）IU/L、（6.20±1.05）IU/L、（6.08±0.26）IU/L比（7.38±0.99）IU/L；（104.46±10.25）ng/L，（104.48±12.85）ng/L，（106.64±8.67）ng/L比（94.04±6.22）ng/L，P均＜0.05]；血清LH含量水平虽降低，但差异无统计学意义[（2.96±0.38）ng/L、（3.00±0.19）ng/L、（2.96±0.23）ng/L比（3.35±0.27）ng/L，P＞0.05]。给药后第14天，与模型组比较，调经汤中剂量组大鼠血清FSH、LH降低，E2升高，差异有统计学意义[（7.02±1.04）IU/L比（8.01±0.13）IU/L，（3.37±0.53）ng/L比（4.22±0.82）ng/L，（153.67±20.55）ng/L比（131.74±23.65）ng/L，P均＜0.05]。模型组大鼠卵巢萎缩，卵泡生长少，闭锁卵泡增加，部分被纤维组织代替，黄体数量少，子宫内膜明显变薄。调经汤低、中、高剂量组大鼠卵泡数量和黄体数目不同程度增多，子宫内膜有所增厚。结论调经汤能有效改善顺铂诱导的卵巢早衰模型大鼠的卵巢功能。

大鼠；卵巢早衰；调经汤；顺铂

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指妇女在40岁之前由于卵巢功能提前衰竭而导致闭经的现象[1-2]。POF临床诊断标准为年龄＜40岁，闭经时间≥4个月，间隔1个月以上的两次血清促卵泡激素＞40mIU/mL，雌二醇（E2）＜73.2pmol/L，且超声波显示卵巢和子宫缩小，卵巢中无卵泡[3]。“调经汤”源自陈木扇女科经典著作《陈素庵妇科补解》中的“大调经丸”，由当归、川芎、麸白芍、熟地黄、白术等组成。经临床观察发现，调经汤能延长女性的绝经年龄，重建规律的月经周期，改善早衰女性的卵巢功能。本文旨在通过动物实验研究，初步探索调经汤治疗卵巢早衰可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物成熟雌性未交配Wistar大鼠60只，体质量180～220g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.2 药物及试剂调经汤组成：当归、川芎、麸白芍、熟地黄、白术等十六味中药（浙江中医药大学中药饮片厂，经鉴定为合格的中药饮片）。注射用顺铂（冻干型）（齐鲁制药有限公司，批号1507112）；0.9%氯化钠注射液（杭州民生药业有限公司，批号1503571）；HE染色液（三明市和众生物技术有限公司，批号1410068）；戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司，批号1511085）；

2 实验方法

2.1 调经汤提取液制备取单帖处方剂量的“调经汤”饮片，用10倍量（体积/重量）水浸泡30min，然后煎煮1h，滤过得一次水提液；滤渣再加8倍量（体积/重量）水煎煮40min，滤过得二次水提液。合并两次滤液，常压浓缩至5、2.5、1.25g/mL，分别用于调经汤高、中、低剂量组。

2.2 动物分组与喂养将60只Wistar大鼠随机分成空白对照组、模型组、阳性药物对照组、调经汤低、中、高剂量组，每组10只。用苦味酸分别标记，常规饲料喂养。所有动物均饲养于屏障系统的IVE笼具中，相对湿度50%～70%，温度22℃±1℃，12h明暗交替，15～20次/h的换风次数，噪音小于50d。

2.3 卵巢早衰大鼠模型建立[4]空白组大鼠按0.4mL/100g体质量腹腔注射无菌注射用水，其余各组大鼠按0.4mL/100g体质量腹腔注射浓度0.5mg/mL顺铂溶液，连续7天，造成免疫性卵巢早衰大鼠模型。

2.4 给药造模24h后开始分组给药，空白对照组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃；阳性对照组给予浓度为1.25mg/100mL的雌二醇溶液；治疗组分别给予低剂量（0.5g/100g体质量）、中剂量（1g/100g体质量）、高剂量（2g/100g体质量）调经汤水煎液灌胃均1天2次，连续14天。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 各组大鼠行为学变化在实验过程中，每天观察各组大鼠饮食量、活动量、体毛、反应和大便性状等外在表现的差异。

2.5.2 各组大鼠动情周期变化在实验过程中，每天定时取各组大鼠阴道分泌物，做阴道涂片，置于显微镜下观察六组大鼠的动情周期变化。

2.5.3 各组大鼠血清性激素变化分别于给药第7、14天，禁食不禁水12h以上，眼眶内眦取血，静置后离心（3000r/min）20min，取上清液送检，用放免法测定血清性激素水平。

2.5.4 卵巢组织形态学变化治疗14天后将大鼠断颈处死后剖腹取卵巢、子宫，置于中性甲醛液中固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下观察大鼠卵巢组织形态变化。

2.6 统计学方法实验数据应用SPSS12.0统计软件处理，采用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 行为学变化实验前后对比，空白对照组大鼠无明显异常表现，状态良好，行为敏捷，皮毛光滑，大便性状良好。造模后，模型组大鼠的体质量均明显减轻，且随着造模时间的推移，绝大部分大鼠进食逐渐减少，形体逐渐消瘦，反应变得迟钝，蜷缩扎堆，皮毛暗淡，毛发蓬松，大便性状发生变化，变得湿软，臭味明显加重。药物治疗后，阳性药物对照组大鼠恢复最慢，调经汤组大鼠活动量逐渐增加，进食逐渐增多，大便性状逐渐往正常水平恢复，其中属高剂量调经汤组大鼠恢复最佳。

3.2 动情周期变化造模前，各组大鼠的动情周期均为3～5天，动情间期、动情前期、动情期、动情后期交替出现。各期阴道脱落细胞变化表现为动情间期/静止期：大部分为白细胞，混有少量较小的有核扁平上皮细胞；动情前期：大部分为膨大的椭圆形有核上皮细胞；动情期：膨大的上皮细胞消失，成为鳞状脱落的角化上皮细胞；动情后期：出现卵原细胞并逐渐增多。造模7天后，空白对照组大鼠动情周期稳定，为3～5天；其余五大组大鼠动情周期紊乱，失去正常动情周期变化，表现为持续的动情间期、无动情前期及动情期，周期延长至5～8天，阴道涂片可见白细胞、上皮细胞和角化的上皮细胞。治疗14天后，调经汤低、中剂量组大鼠动情周期逐渐缩短为5～7天，其中调经汤高剂量组大鼠动情周期为4～6天。见封三图1。

图1 实验第12天各组大鼠阴道脱落细胞图（Giemsa染色，×100）

图2 各组大鼠卵巢组织形态（HE染色，×200）

3.3 血清性激素含量变化给药7天后，与空白对照组比较，模型组大鼠血清FSH和LH水平升高，E2含量降低（P均＜0.05）；与模型组比较，阳性药物对照组、调经汤低、中、高剂量组大鼠血清FSH明显降低，E2含量显著升高（P均＜0.05）。给药14天后，与空白对照组比较，模型组大鼠血清FSH和LH升高、E2含量降低（P均＜0.05）；阳性药物对照组大鼠血清E2含量降低（P＜0.05）。与模型组比较，调经汤中剂量组大鼠血清FSH和LH含量降低、E2含量升高（P＜0.05），调经汤高剂量组大鼠血清FSH含量降低（P＜0.05）。见表1。

3.4 卵巢组织形态学变化空白对照组大鼠卵泡数量多，颗粒细胞层次多，各级卵泡类型明显，黄体发育好，体积大，数量多，子宫内膜厚。模型组大鼠卵巢体萎缩，卵泡生长少，未见成熟的卵泡，闭锁卵泡增加，部分被纤维组织代替，黄体数量少。阳性药物对照组大鼠卵巢体萎缩未见明显恢复，卵泡生长略有所增多，未见成熟卵泡，闭锁卵泡略减少，黄体数量略增多；调经汤各组大鼠均有明显好转趋势，成熟卵泡数量明显增加，卵泡液含量也有所增多，黄体数目明显增多，体积变大，其中属调经汤高剂量组大鼠恢复最明显。各组大鼠卵巢组织形态见封三图2。

4 讨论

雌激素能促使细胞合成DNA、RNA和相应组织内各种不同的蛋白质，从而促使子宫内膜增生，增强子宫平滑肌的收缩，临床用于治疗卵巢机能不全或卵巢激素不足引起的各种症状。但是17β-雌二醇在体内有抑制LH分泌的作用[5]，会推迟卵泡生长。本研究显示，阳性对照组大鼠卵巢卵泡数量少，未见明显成熟卵泡，闭锁卵泡多，黄体数量少，体积小。阴道涂片观察可见大鼠没有稳定的动情周期变化。调经汤组大鼠成熟卵泡数量明显增加，卵泡液含量也有所增多，黄体数目明显增多，体积也明显变大，子宫内膜也有所增厚。阴道涂片分析可见大鼠的动情周期变化逐渐恢复稳定。说明调经汤对顺铂致卵巢早熟模型大鼠的治疗效果优于雌二醇。

表1 各组大鼠治疗后血清性激素含量比较（±s）

表1 各组大鼠治疗后血清性激素含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；FSH：促卵泡生成素；E2：雌激素；LH：促黄体生成素

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本研究显示，利用顺铂建立雌性大鼠卵巢早衰动物模型，成功损伤卵巢功能，影响卵泡的正常生长发育及排卵过程，导致卵泡丢失、闭锁、不排卵，调经汤对卵巢早衰模型大鼠修复卵巢功能具有较高的疗效。

［1］李茜西，吕德欣.卵巢早衰的病因及治疗研究进展［J］.中国医药导报，2014，11（30）：164-168.

［2］丰有吉，沈悭.妇产科学［M］.北京：人民卫生出版社，2010：252.

［3］徐苓，宋亦军.卵巢早衰的临床表现和诊断标准［J］.实用妇产科杂志，2003，19（4）：195-196.

［4］张丽娟，陶仕英，赵丕文，等.顺铂建立大鼠卵巢模型的实验研究［J］.世界中医药，2015，10（10）：1563-1569.

［5］方溪.17β-雌二醇对动情后期大鼠的离体垂体小片进行表面灌流其促性腺激素分泌有急性抑制性影响［J］.国际妇产科学杂志，1991，5（5）：92-98.

Effect of Tiaojing Decoction on Treatment of Premature Ovarian Failure in Rats

SHEN Wei1,CHEN Xueqi2.
1 Drug Preparation Center,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China.2 Department of Gynecology，the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Tiaojing decoction on treatment of premature ovarian failure in rats.MethodsSixty female adult rats were randomly divided into blank group,model group,positive drug control group,andlow-,medium-,and high-dose of Tiaojing decoction groups,with 10 rats in each group.Premature ovarian failure rat model was established through 7-consecutive-day intraperitoneal injection of cisplatin solution in all groups except for blank group.The oestrous cycle was observed,the variation in content of FSH,E2,LH was detected with radioimmunoassay and ovarian pathological changes were observed under light microscope in all group.ResultsThe model group and positive drug control had no stable estrous cycle while high-dose and medium dose Tiaojing decoction group gradually restored the estrous cycle.On day 7 and 14,the serum FSH（Day7:7.38±0.99IU/L,Day 14:8.01±0.13IU/L）and LH（Day 7:3.35±0.27）ng/L,Day 14:4.22±0.82ng/L）increased and E2（Day 7:94.04±6.22ng/L,Day 14:131.74±23.65ng/L）decreased compared with those in blank group（FSH:Day 7:6.18±0.24IU/L,Day 14:6.97±0.88IU/L;LH:Day 7:2.79±0.24ng/L,Day 14:3.20±0.17ng/L;E2:Day 7:109.10±5.69ng/L,Day 14:157.82±5.68ng/L）,all withP＜0.05;on day 7,compared with those in the model group,the serum FSH content decreased and E2 content increased in the low-,middle-and high-dose Tiaojing decoction groups（FSH:5.72±0.51IU/L,6.20±1.05IU/L,6.08±0.26IU/L;E2:104.46±10.25ng/L,104.48±12.85ng/L,106.64±8.67ng/L,allP＜0.05）,but the serum LH level decreased without significant difference（2.96±0.38ng/L,3.00±0.19ng/L,2.96±0.23ng/L,P＞0.05）;on day 14,the FSH（7.02±1.04IU/L）and LH（3.37±0.53ng/L）in the middledose of Tiaojing decoction group were lower and E2（153.67±20.55ng/L）was higher than those in the model group（P＜0.05）.Ovarian tissue pathological changes such as ovarian volume contraction,less follicular growth,increase in atresia follicles,partly replaced by fibrous tissue,less corpus luteum in number,and thinner endometrium were observed in the model group.These pathological changes were improved in Tiaojing decoction groups,such as more follicular growth,increase in corpus luteum number,and thicker endometrium.ConclusionTiaojing decoction can improve the ovarian function of rats with premature ovarian failure induced by cisplatin.

rats;premature ovarian failure;Tiaojing decoction;cisplatin

浙江省中医药科技计划（No.2014ZA047）；浙江省中医药科技计划（2015ZA114）；浙江省中医药科技计划（No.2016ZA112）；浙江省中医药科技计划（No.2017ZZ009）

1浙江中医药大学附属第一医院制剂中心（杭州310006）；2浙江中医药大学附属第三医院妇科（杭州310006）

陈学奇，Tel：057187071760；E-mail：1810633261@qq.com

（收稿：2017-06-06修回：2017-07-14）