热处理对牛乳蛋白质消化率的影响

刘晓，姜竹茂，芦晶，张书文，刘鹭，逄晓阳，吕加平

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

热处理对牛乳蛋白质消化率的影响

刘晓1，2，姜竹茂2，芦晶1，张书文1，刘鹭1，逄晓阳1，吕加平1

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

采用体外模拟胃肠道消化的方法研究了不同热处理对牛乳蛋白消化的影响，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）、高效液相色谱（HPLC）和尺寸排阻高效液相色谱等方法对各个成分进行检测。结果表明：随着热处理温度的升高，蛋白消化能力逐步降低；鲜牛乳中蛋白质被消化为游离氨基酸及小肽的程度较加热乳制品高；乳中蛋白质经消化主要生成分子量低于1500 u的肽段，易于人体消化吸收。

热处理；消化率；体外模拟；肽段；氨基酸

0 引言

牛乳营养丰富，含有人体所需的氨基酸、矿物质、维生素及优质蛋白，一直认为是人类膳食中最接近完美的食品之一[1]。热处理是乳品加工的一个不可或缺的关键环节，一方面加热可以杀死牛乳中的致病菌，保障牛乳的货架期，同时还可以获得独特的风味物质[2]；另一方面，热处理也会对牛乳品质产生负面影响，例如会导致牛乳营养成分损失，蛋白质变性等[3]。乳中各个成分中，乳蛋白对热较为敏感，加热处理可能会造成乳蛋白性质变化、或者与乳中碳水化合物、盐类等共同发生变化[4-5]，直接影响了牛乳营养及功能特性[6]。由于蛋白质在牛奶营养成分中的重要性及对热的敏感性，热处理对牛奶蛋白质品质的影响已经引起很多研究人员的重视，并取得了重要的进展，对指导乳品加工及保证产品品质具有重要意义。

本文主要以牛乳蛋白质为研究对象，通过体外模拟蛋白消化，采用组学等技术对消化后牛乳蛋白成分、蛋白消化率、功能肽段等进行研究，从而揭示热处理对牛乳蛋白消化的影响规律，为今后相关研究奠定基础。

1 实验

1.1 材料与试剂

鲜牛乳（市售），α-淀粉酶，溶菌酶，黏蛋白，牛血清蛋白，胃蛋白酶，胰液素，胆盐，氯化钙，磷酸二氢钠，丙烯酰胺，过硫酸铵（均为分析纯），四甲基乙二胺，考马斯亮蓝R250，蛋白质Marker等。

1.2 仪器与设备

UV-2300型紫外可见分光光度计；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱；脱色摇床TS-1；漩涡混合器MVS-1；SC-15数控超级恒温槽；3K-15离心机；DELTA 320 pH计；BSA 124S-CW分析天平；EPS301电泳仪。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

样品制备：新鲜牛乳分别进行巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌（UHT）。其中巴氏杀菌的条件是85℃，10 s；UHT灭菌的条件是135℃，5 s。乳粉是鲜牛乳进行巴氏杀菌后进行喷雾干燥，进口温度为180℃，出口温度为80℃。

1.3.2 体外模拟消化[7]

蛋白质的消化主要分为胃液消化和肠液消化。胃液中的胃蛋白酶和肠液中的胰蛋白酶都为内切酶，其中胃液中的胃蛋白酶主要作用部位为芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键；而肠液中的胰蛋白酶主要作用在碳端连接赖氨酸和精氨酸残基的肽键。食物进入胃之后，胃蛋白酶会将食物中的蛋白质分解成肽段，然后受小肠中由胰腺分泌的胰蛋白酶的作用，分解成大量的小分子肽段和少量的游离氨基酸，其中肽主要由2～6个氨基酸残基组成。

（1）消化液的配制

体外消化液根据文献[8]中方法，消化液的质量浓度从文献中得出[9]，分别配制唾液消化液、胃液、胰液、和胆汁4种消化液（配制方法如表1）。

（2）胃液消化

①取热处理牛乳样品2.25 mL，加入唾液消化液3 mL，37 ℃保温5 min。

②然后取6 mL的胃液加入上述唾液消化样品中，37℃振摇120 min。

（3）肠液消化

向胃消化后的样品同时加入6 mL的胰液和3 mL的胆汁，37℃振摇120 min。消化后的样品要尽快放入-80℃的冰箱冻存，以防样品变质，影响实验结果。

1.3.3 凝胶电泳[10-11]

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）按照蛋白质分子量的大小进行蛋白分离。样品取自鲜牛乳和热处理样品，以及在胃消化和肠消化后的各个样品，进行电泳，分离大于5 ku的蛋白。使用分离胶的质量分数为12%。电泳所用marker分子量范围在14.4～94 ku之间。测定样品的蛋白含量，将样品稀释，最终确定所有的样品蛋白含量相同，与上样缓冲液等量混合，沸水浴3～5 min，离心2 min，取10 μL样品进行上样，电泳结束后，凝胶使用考马斯亮蓝染色液进行染色。

1.3.4 蛋白消化率的测定

牛乳经过凝胶电泳后，计算每种蛋白的灰度值，根据下列公式进行计算，即

蛋白消化率/%=（原样中蛋白灰度值-消化后蛋白灰度值）/原样蛋白灰度值×100

1.3.5 游离氨基酸及短肽的测定[12-13]

蛋白质和较长的肽段用浓度为0.5 mol/L的高氯酸沉淀。和在巯基乙醇酸中的邻苯二甲醛（OPA）反应后的上清液中的氨基酸和肽段在340 nm下测定。具体如下：

① 25 μL样品和25 μL高氯酸（5 mol/L）混合，用75 μL水稀释，在4℃下保温15 min。

②离心，取30 μL上清液与反应溶液（0.05 mol/L硼酸盐，10 g/L十二烷基硫酸盐，0.8 g/L OPA，5 g/L吗啉乙磺酸钠盐Na-MES和质量浓度为5 g/L的Tri⁃ton X-100混合比例为1∶30）在室温下黑暗培育40 min，在340 nm下测定吸光度。

表1 模拟消化液组分

1.3.6 游离氨基酸成分的测定（HPLC）[14]

取25 μL样品，加入200 μL乙腈沉淀蛋白，转速为7 000 r/min，离心1 min，移取上清液，55℃真空干燥。样品干燥后，用25 μL超纯水复溶。吸取10 μL复溶样品进行衍生化处理，用液相进样针吸取25 μL衍生化样品进行色谱分离及测定。色谱条件如下：Nova-Pak C18色谱柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流动相A按照1∶10将AccQ·TagA浓液用水稀释；流动相B为乙腈/水（60/40）；流速 1.0 mL/min，柱温 37 ℃；波长为248 nm。

1.3.7 肽段长度分布的检测[15]

消化的样品用滤管离心过滤，10 000 g/min，离心30 min，取滤液，用尺寸排阻色谱柱分离，并进行分析，其中色谱标准品的分子量的选择要包含所有样品肽段的分子量。BioBasic SEC-300色谱柱（7.8 mm×150 mm）；缓冲液A∶50%水∶50%乙腈∶0.1%甲酸；流速为0.5 mL/min，在214 nm下色谱分离并检测。

表2 不同热处理乳蛋白的胃液消化率

2 结果与分析

2.1 热处理对牛乳蛋白消化程度的影响

牛乳中蛋白质的主要成分有酪蛋白（α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白）和乳清蛋白（α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）。由图1可见，随着热处理温度的升高，消化液蛋白条带的色度逐渐降低，蛋白质的含量在不断减少。经过胃液消化后，蛋白质含量明显减少，但不能完全被消化，其中鲜牛乳的蛋白消化最为显著。牛乳经过肠液消化后基本消化完全，蛋白消化率达到90%以上。其中以β-乳球蛋白为例，发现β-乳球蛋白在经过胃液消化后变化不明显，而经过肠液消化后消化完全。其中，以表2可知，胃液消化过程中，不同热处理条件下，各种蛋白成分的消化率都存在很大差异，而表3中，肠液消化过程中，各种蛋白成分消化率差异很小，说明各个蛋白组分基本消化完全。所以样品经过胃液消化和肠液消化后，蛋白质基本消化完全，其中鲜牛乳的蛋白消化率最高。

表3 不同热处理乳蛋白的肠液消化率

图1 热处理样品蛋白消化液SDS-PAGE

图1中，0代表marker；A-1，B-1，C-1分别代表鲜牛乳样品；A-2，B-2，C-2分别代表巴氏杀菌乳样品；A-3，B-3，C-3代表UHT乳样品；A-4，B-4，C-4代表乳粉样品。

2.2 热处理对游离氨基酸及短肽质量分数的影响

蛋白质是由不同的氨基酸以肽键连接，按一定序列、比例、排列方式组成，在维持机体的组织结构、生长、新陈代谢、实现各种生理功能等方面发挥着重要作用[16-17]。由于游离氨基酸是人体可直接吸收的营养成分，它的质量分数和成分能够部分地反映出牛乳的营养价值。研究热处理对氨基酸消化吸收的影响，是非常有意义的。

通过OPA法检测消化样品游离氨基酸及短肽（＜4个氨基酸）质量分数，肠液消化后氨基酸及短肽质量分数高于胃消化后的氨基酸质量分数。在胃液消化后，随着热处理温度的升高，氨基酸及短肽的质量分数呈现下降趋势，这有可能是由于温度升高，一方面部分蛋白变性，致使氨基酸及短肽含量减少，另一方面蛋白质与糖发生美拉德反应，使可被胃蛋白酶消化的氨基酸含量减少[18，19]。但是在肠液消化过程中，随着热处理温度的升高，氨基酸及短肽含量不断增多，造成这一现象是经过热处理后的牛乳蛋白变性，其构象发生改变，结构展开，蛋白酶的内切位点增多，对胰蛋白酶更加敏感，由于蛋白酶的作用，牛乳中的蛋白质消化完全，更宜于分解成游离的氨基酸及小分子肽类[20-21]。

由图3和图4可以看出，样品经过肠液消化后，由于胰蛋白酶和胆汁的消化作用，大分子蛋白质及其肽段分解成氨基酸，致使氨基酸各个成分的质量分数明显增多，也说明蛋白质消化主要是肠液消化过程。根据图3，随着热处理温度的不同，氨基酸各个成分质量分数发生很大变化。胃液消化后，赖氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和亮氨酸的质量分数随热处理温度的升高而显著降低；而组氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量则显著上升[22-23]，其中乳粉中组氨酸的质量分数最高。图4为热处理样品肠液消化后的氨基酸质量分数。图4中，鲜牛乳中除了组氨酸、精氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸含量在4种样品中较低外，其他氨基酸的质量分数在4种样品中含量最高。4种样品经胃肠液模拟消化后，鲜牛乳生成游离氨基酸的质量分数显著高于其他3种乳制品，说明鲜牛乳蛋白质完全消化水平较其他样品高。

图2 消化样品游离氨基酸及小肽的含量

图3 胃液消化样品氨基酸质量分数

图4 肠液消化样品氨基酸质量分数

2.4 蛋白质体外消化后肽段分布情况

本文利用蛋白纯化系统分析乳蛋白经体外消化后肽段的分布情况，结果如图5和图6所示。

由图可见，消化样品肽段分子量主要是在1 500 u以内，主要在300～1 500 u之间，即由大约2～12个氨基酸组成，有研究表明，成年的动物肠液消化吸收的肽段长度从3肽到51肽[24]，这说明乳中蛋白质被消化为可吸收利用的肽段及氨基酸比例很高，4种样品＜1 500 u的肽段含量均超过90%。如图6所示，乳中蛋白质经肠液进一步消化，300～1 500 u的肽段含量有所降低，但仍为主要消化产物，小于300u的肽段含量逐渐增高。

3 结论

本文通过体外模拟消化的方法，研究热处理对蛋白消化的影响规律。结果表明：

图5 不同热处理样品胃消化后肽段分子量

图6 不同热处理样品肠消化后肽段分子量分布

（1）在胃液消化过程中，蛋白消化不完全，在小肠内进一步消化为小分子量肽段及游离氨基酸。

（2）SDS-PAGE分析显示，鲜牛乳中蛋白质的消化率较加热乳制品中蛋白质消化率高

（3）通过测定消化后游离氨基酸含量发现，鲜牛乳中蛋白质被完全消化为游离氨基酸程度较加热乳制品高。

（4）随着样品热处理程度的增高，消化产物中氨基酸与小分子量肽段（＜4肽）的含量逐渐增高。

（5）乳中蛋白质经消化主要生成分子量低于1 500 u的肽段，易于人体消化吸收。

热处理温度的不同，对蛋白消化的影响也不同，选择合适的热处理方式对乳品工业非常重要。

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Effect of heat-treatment process on the digestibility of milk protein

LIU Xiao1,2，JIANG Zhumao2，LU Jing1，ZHANG Shuwen1，LIU Lu1，PANG Xiaoyang1，LYU Jiaping1
（1.Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijng 100193，China；2.College of Life Sciences，Yantai University，Shandong，Yantai 264005，China）

The effect of heat treatment on the digestion of milk protein was studied by in vitro digestion of gastrointestinal tract.The compo⁃nents were tested by polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE），high performance liquid chromatography（HPLC）and size exclusion high performance liquid chromatography（HPLC）.Research shows that with the increase of heat treatment temperature，the digestibility of protein was decreased，the amount of free amino acids and peptides released by protein in raw milk was higher than that in heated milk sam⁃ples.The proteins were mainly digested into peptides with the molecular weight lower than 1 500 u，which were easily absorbed by human.

heat treatment；digestibility；vitro gastrointestinal；peptide；amino acids

TS252.1

A

1001-2230（2017）11-0014-05

2017-03-07

国家自然科学基金（31671878）；国家自然科学基金（31401514）；国家科技支撑计划（2013BAD18B10）；现代农业产业技术体系北京市奶牛产业创新团队；公益性行业科研专项（201303085）。

刘晓（1990-），女，硕士，研究方向为乳品科学技术。

吕加平