乳酸菌胞外多糖研究进展

索超，曲晓军，崔艳华

（1.哈尔滨工业大学化工与化学学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

乳酸菌胞外多糖研究进展

索超1，曲晓军2，崔艳华1

（1.哈尔滨工业大学化工与化学学院，哈尔滨 150090；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

胞外多糖作为乳酸菌重要的次级代谢产物，形式多样，种类繁多,存在着明显的差异。本文就乳酸菌菌胞外多糖的分类、组成及结构、生物合成及遗传调控、构效关系进行了综述，旨为胞外多糖研究、尤其是胞外多糖的构效关系提供参考。

乳酸菌；胞外多糖；遗传调控；构效关系

0 引言

微生物胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）主要是由细菌、真菌和蓝绿藻产生的高分子量的碳水化合物。乳酸菌胞外多糖分子量在4×104到6×106之间，是乳酸菌生长代谢过程中重要的次生代谢产物，具有广泛的用途。例如，EPS是天然增稠剂，可以有效改善酸奶和奶酪的黏度和质地，为发酵乳制品提供良好的流变效应，改善乳制品的口感，且具有防止酸奶的脱水收缩的作用[1-2]。乳酸菌EPS已广泛用于食品生产，在食品的稳定、持水、乳化及增稠等方面发挥作用。同时，研究发现某些乳酸菌EPS具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等益生特性。本文对乳酸菌EPS的分类、组成及结构、生物合成及遗传调控和构效关系方面进行阐述，旨在为今后通过基因改良的方法改变EPS结构、提高EPS生物活性提供参考。

1 乳酸菌合成胞外多糖菌群及胞外多糖的分类

目前，已发现多种乳酸菌可产胞外多糖，包括乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属和乳球菌属等，其中研究最多的为链球菌属的嗜热链球菌[3-4]。

乳酸菌产生的胞外多糖可以基于它们的单糖组成不同，分为同型多糖和异型多糖。同型多糖是由一种单糖聚合而成，其中单糖种类包括四类：α-D-葡聚糖，β-D-葡聚糖，β-D-果聚糖和聚半乳糖[4]。肠膜明串珠菌所产的EPS是同型多糖的典型代表，其单糖组分为α-D-葡聚糖，又称右旋糖苷。异型多糖是由重复单元聚合而成，其中重复单元组成以D-葡萄糖，D-半乳糖和L-鼠李糖最为常见。有些还含有其他的一些成分，如：L-岩藻糖、乙酰化氨基糖（例如N-乙酰基-D-半乳糖胺）、D-核糖、D-葡萄糖醛酸和D-壬酸，以及非糖组分如甘油、磷酸盐、丙酮酰基和乙酰基等[5-6]。

2 乳酸菌胞外多糖的组成及结构

同型多糖组分简单，仅由一种单糖聚合而成。本文主要介绍异型多糖的组成及结构，异型多糖主要的单糖有D-半乳糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖。这些单糖在酶的作用下，通过α或β糖苷键连接形成基本重复单元，最后再聚合为不同分子量的异型多糖。多糖的一级结构决定了多糖的高级结构，而多糖的一级结构主要包括不同单糖糖基组成比例，单糖糖基之间的排列顺序，相邻单糖糖基的连接方式及糖链的分支情况[5，7]。将产胞外多糖的乳酸菌菌株及其所产胞外多糖的组成和结构汇总到表1。

表1 产胞外多糖的乳酸菌菌株及其所产胞外多糖的组成和结构

3 乳酸菌胞外多糖生物合成及遗传调控

3.1 生物合成途径

同型多糖合成过程相对简单，合成过程主要发生在细胞壁上，通过糖基转移酶作用胞外单糖转移到胞内糖链上。而异型多糖生物合成较为复杂。合成体系主要由糖基核苷酸、酰基供体、脂中间体、酶系统和糖基受体（脂载体十一异戊烯磷酸）5个部分构成。在细胞膜上，胞内糖基核苷酸在糖基转移酶催化作用下，进一步实现聚合[16]。下面以嗜热链球菌ST 1275为例，阐述异型多糖代谢途径（图1）。

图1 嗜热链球菌糖代谢与胞外多糖合成途径[17]

图1中，数字代表所涉及的酶：1，β-半乳糖苷酶；2，葡萄糖激酶；3，α-磷酸葡萄糖变位酶；4，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；5，UDP-葡萄糖-4-差向异构酶；6，UDP-半乳糖-4-差向异构酶；7，半乳糖-1-磷酸-尿苷酰转移酶；8，半乳糖变旋酶；9，半乳糖激酶；10，dT⁃DP-葡萄糖焦磷酸化酶；11，dTDP-葡萄糖-4，6-脱氢酶；12，dTDP-4酮基-6-脱氧葡萄糖-3，5-差向异构酶；13，dTDP-4-酮基-L-鼠李糖还原酶；14，果糖激酶；15，6-磷酸果糖激酶；16，磷酸葡萄糖异构酶；17，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶；18，磷酸葡糖胺变位酶；19和20，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶（双功能）；21，UDP-吡喃半乳糖变位酶。

字母代表编码相应酶的基因：a，galU编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因；b，galE编码UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因；c，rfbA编码dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因；d，rfbB编码dTDP-葡萄糖-4，6-脱氢酶的基因；e，rfbC编码dTDP-4-酮基-6-脱氧葡萄糖-3，5-差向异构酶的基因。

在嗜热链球菌ST 1275菌株中，葡萄糖在通透酶的催化作用下，由胞外进入胞内。随后经过磷酸化，一部分进入糖酵解途径，另一部分进入胞外多糖合成途径。α-D-6-P-葡萄糖作为连接糖酵解途径与胞外多糖途径关键物质，其可以在磷酸变位酶催化下，生成α-D-1-P-葡萄糖，随后α-D-1-P-葡萄糖作为中心代谢物通过一系列酶的催化作用，生成dTDP-鼠李糖、UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖等的多糖合成前体，之后经过特定胞外多糖酶实现前体装配，最终合成胞外多糖聚合分泌到胞外。此外，该菌可通过利用谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶对β-D-6-P-果糖的催化作用生成UDP-N-乙酰-葡萄糖胺，它也是合成胞外多糖重要的前体物质。

通过Wu等人对S.thermophilus ST 1275胞外多糖合成途径的分析，ST 1275除了可以利用乳糖、半乳糖和葡萄糖外，还可以发酵果糖。然而，只有蔗糖和果糖这二种糖可以通过特异性的磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PEP-PTS）进行转运，而乳糖和葡萄糖则无法利用PEP-PTS实现转运[17]。

3.2 遗传调控

近年来，有关嗜热链球菌和乳球菌EPS基因簇及其基因产物的功能研究越来越多[18-19]。首先从遗传学角度来说，胞外多糖生成是由许多基因簇编码，之后通过转录生成单个多顺反子mRNA，并协调表达。EPS基因簇的结构大致分为4个部分，分别为编码各糖基转移酶的区域、控制基因簇转录的调控区域、编码控制糖单元聚合输出的区域、编码决定多糖链长度的区域[20]。

以目前研究基因簇调控机制最明确的4个菌株为（S.thermophilus的 ST 1275、CNRZ 1066、LMG 18311菌株；Lactococcus lactis NIZO B40 和 Lactobacillus bulgari⁃cus Lfi5），其各个菌株编码多糖基因簇及各片段相关功能示意图如图2所示。

图2 各个菌株编码多糖基因簇及各片段相关功能

在S.thermophilus ST 1275菌株的编码多糖基因簇中，epsA和epsB用于生物合成调节同时eps1C和eps1D用于确定胞外多糖链的长度[21-22]。epsE基因编码膜相关的糖基转移酶，其功能是将1-磷酸-糖基转移至细胞膜胞质面上的十一聚类异戊二烯醇磷酸酯（C55-lipid-p）糖基载体上，但并不催化糖苷键。随后，编码糖基转移酶epsF，epsG，epsH，epsI，epsJ和epsK可以转移各种糖基核苷酸（包括UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖，dTDP-鼠李糖，UDP-N-乙酰-葡萄糖胺和UDP-半乳糖呋喃糖）以形成多糖的重复单元[23-24]。此外，在该基因簇中还发现了用于合成UDP-呋喃半乳糖的UDP-吡喃半乳糖变位酶。同时发现eps2C和eps2D这两个基因与决定多糖链长度有关。ST 1275基因组中决定胞外多糖链长度的两对基因（即eps1C-eps1D和eps2C-eps2D）的发现意味着可以产生不同分子大小的胞外多糖。重复单元的聚合和易位的特定功能分别通过epsL和epsN实现。epsO和epsP在磷酸化中起作用，而epsQ的功能为用于胞外多糖在膜和肽聚糖层之间的转移。研究表明，分布在菌株的所有eps基因簇中的orf14.9基因与嗜热链球菌的细胞生长相关[25]。通过对菌株eps基因簇的各种结构的了解，表明胞外多糖的合成与其化学结构具有菌株特异性[23，26]。

在L.lactis NIZO B40菌株的编码多糖基因簇中，espR作用是调控蛋白质的表达，而espA和espB是决定多糖的链espDEFGH调控糖基转移酶的产生，epsI和epsK的作用分别是调控蛋白质的聚合与输出。至于espX，espC，espL，espJ的功能目前还不清楚。需要注意的是espD主要是调控起始糖基核苷酸转移酶，这种酶的作用就是将UDP-葡萄糖中的葡萄糖转运到脂载体上，构成多糖主链骨架，这一过程是胞外多糖生物合成的第一步，非常重要[27]。

在胞外多糖合成过程中，除了胞外多糖基因簇具有调控蛋白质合成、决定多糖重复单元的合成、决定多糖的链长以及蛋白质聚合与输出等功能外，还有许多例如galU，galE和pgm等的持家基因也参与了胞外多糖的生物合成，其主要功能是编码对胞外多糖合成前体的关键酶[16]。Svensson等人通过改变参与核苷酸糖代谢的中枢碳代谢中的酶的活性方式提高嗜热链球菌LY03产EPS的水平[28]。

4 构效关系

不同乳酸菌EPS结构有很大的不同，其结构的差异必然导致其生物活性的不同。研究表明，多糖的一级结构包括单糖糖基，单糖糖基之间的排列顺序，相邻单糖糖基的连接方式以及糖链的分支情况等，每一种影响一级结构的因素对多糖的功能都会产生影响。

多糖的抗肿瘤活性与葡萄糖链上糖苷键类型有关。β-糖苷键比α-糖苷键构成的葡聚糖的抗肿瘤活性高，其中葡萄糖链上的β-1，3糖苷键和β-1，6糖苷键是具备抗肿瘤活性的必要条件[29]。经过乙酰化修饰的β-1，6糖苷键的葡聚糖，具有抗肿瘤活性，消除乙酰化修饰，抗肿瘤活性消失。经Hamuor发现具有β-1，3糖苷键的葡萄糖链骨架上由于具有多羟基基团，对抗肿瘤活性起到重要作用[30]。除此之外，胞外多糖其链长，支链组成对其致密性具有很大影响，从而改变多糖的流变性质。

同样胞外多糖的抗氧化活性与其结构具有一定关系。多糖中的羟基与氧自由基间有相互作用，同时随着羟基数目的增多，其抗氧化活性增强。研究表明，嗜热链球菌胞外多糖通过硫酸酯化后，其多糖的抗氧化活性与抗菌活性得到显著提高[31]。Li等人，通过对嗜热链球菌ASCC 1275胞外多糖进行硫酸化，通过二苯基硝基苯肼（DPPH），超氧化物和羟基自由基清除试验和三价铁还原抗氧化能力测定法对硫酸化胞外多糖的抗氧化活性进行测定。结果表明，硫酸化修饰胞外多糖的抗氧化活性显着提高（P＜0.05）[32]。EPS的性质还可以通过化学改性或与其它生物聚合物和/或交联剂的化学反应进而改变[33]。Zhao等人，通过利用硒化修饰后的多糖与未修饰的多糖作为抗氧化剂对DPPH、羟基自由基和超氧自由基的清除能力，金属螯合能力和体外还原能力进行比较。结果表明，硒化修饰的多糖可以显着增强抗氧化的活性[34]。

乳酸菌胞外多糖的黏度与其浓度有关，具有高粘度的聚合物的先决条件是具有高浓度和高比容量。同时多糖的黏度与其单糖之间的糖苷键有关。在Lac⁃tococcus lactis subsp.cremoris B40菌株产生胞外多糖中，由β-1，4糖苷键比β-1，3或α-1，4连接的链具有更强的刚性，并且α型键比β型键构成的链更具有柔性，进而影响多糖的粘度，除此之外，黏度与多糖分子量增加相关[35]。

多糖中单糖的成分与其功能有很大关系，岩藻糖作为单糖的一种，是公认的稀有糖之一。据报道，含有岩藻糖以及含有岩藻糖的寡糖的制剂具有增强其在药物中（作为抗癌剂或抗炎剂）或化妆品（作为抗衰老剂）的应用的性质[36]。因此，具有高含量的岩藻糖（或其他增值成分）的多糖，可以被看作是有价值的化学品的来源。

5 展望

随着人们生活水平的提高，对食品的安全和健康性越来越重视，乳酸菌产生的胞外多糖做为一种生物源性成分，具有广泛的发展前景。其良好的增稠性能和保水性对食品加工与储存具有重要作用。并且由于胞外多糖还具有抗肿瘤活性，在医学领域也发挥了重要作用。在通过研究乳酸菌遗传背景采用基因工程方法获得高产优质胞外多糖菌株过程中，还需逐步建立和改进食品级的表达系统，同时转基因菌株的安全性也是需要所考虑的。

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Research advances in extracellular polysaccharide produced by Lactic acid bacteria

SUO Chao1，QU Xiaojun2，CUI Yanhua1
（1.Department of Food Science and Engineering，School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；2.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China）

Extracellular polysaccharides（EPS）of Lactic acid bacteria（LAB）are important secondary metabolites，and present high diversities and obvious difference.In this paper，the classification，composition，structure，biosynthesis，genetic regulation，and the relationship between activity and structure of EPS of LAB were reviewed，in order to provide references for the research of EPS，especially in the relationship be⁃tween activity and structure of EPS.

Lactic acid bacteria；exopolysaccharide；gene regulation；structure-function relationship

Q539

B

1001-2230（2017）11-0032-05

2017-04-14

国家自然科学基金资助项目（31471712；31371827）。

索超（1993-），男，硕士研究生，从事分子微生物学研究。

崔艳华