Box-Behnken效应面法优化重楼总皂苷的提取工艺研究*

范少敏，史亚军，张小飞，王 瑜，梁玉琳

陕西中医药大学(咸阳 712046)

·方药纵横·

Box-Behnken效应面法优化重楼总皂苷的提取工艺研究*

范少敏，史亚军，张小飞△，王 瑜，梁玉琳

陕西中医药大学(咸阳 712046)

目的：应用Box-Behnken效应面对重楼中重楼总皂苷的提取工艺进行优化研究。方法：将提取工艺中乙醇的浓度、重楼总皂苷提取时间及液药比作为自变量，重楼总皂苷提取率为因变量，用效应面法选择最佳提取工艺，并将预测值与观测值进行比较。结果：重楼中重楼总皂苷的最佳提取工艺参数采用62.5%浓度乙醇、液药比例为16.5∶1，提取时间为3.0 h。经3批工艺验证验证重楼总皂苷的实际提取量与预测提取量二者的相对误差为2.61%。结论：使用Box-Behnken效应面法优化重楼中重楼总皂苷的提取工艺，方法简便，结果可靠，预测性良好。

重楼属百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，主要产地为云南、陕西，经研究表明其具有清热解毒、抗肿瘤、消肿止痛等功效[1]。重楼的根茎类圆柱形，多较平直，少数弯曲，直径l～6 cm，长4.5～12 cm。重楼属植物为多年生草木。根茎匍匐状，茎单生，直立。叶4至多枚轮生，极少3，具叶柄，披针形到卵形，基部具3条主脉，为网状脉。花单生于叶轮之上，花被和雄蕊4数或更多。花药基部着生，子房近球形，1室侧膜胎座或4-10室具中轴胎座，有胚珠多数。果为浆果或蒴果，不裂或室背开裂，数枚到多数种子。表面黄棕色，少数灰褐色，较平滑;环节较稀疏，突起不明显;茎痕半圆形或扁圆形，不规则排列，表面较平或稍突起。质坚硬，不易折断，断面粉质或角质化。气微，味苦。常用于治疗疗疮痈肿、毒蛇咬伤、跌打伤痛、扭伤癖肿、各种关节炎、带状疤疹、流行性腮腺炎、静脉炎、毛虫皮炎、隐翅虫皮炎、蜂蛰、枕部多发性疥肿等[2],因此在临床上应用广泛。重楼总皂苷是重楼的有效活性成分，现代药理及临床研究表明，重楼总皂苷具有抗菌消炎、止血、镇静镇痛、免疫调节、抗肿瘤等作用[3-4]。现在随着现代医学、化学研究的不断深入，重楼有效成分逐步被分离、鉴定并证实，现己从重楼中分离并鉴定了50多种化合物，主要有甾体皂普、植物甾醇、黄酮苷、蜕皮激素及多糖等,还含有19种氨基酸和30多种微量元素，以甾体皂苷为其主要成分，其中甾体皂苷44种，占总化合物的86%。体内外实验研究证实，重楼具有较好的抗肿瘤作用，从重楼中分离出来的皂苷类成分表明其具有较强的抗肿瘤活性，可通过抑制肿瘤细胞增殖、干扰细胞周期、诱导细胞调亡等机制发挥抗肿瘤的作用[5]等。甾体皂苷作为重楼属植物中最重要的成分，其中2015 版药典已将甾体皂苷作为其质量控制指标，并规定滇重楼和七叶一枝花中重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的总含量不低于0.6%[6]。重楼皂苷的提取方法较多，近年来，文献报道了几种重楼总皂苷提取工艺研究，如微波法提取重楼总皂苷的工艺研究[7-8]。正交设计-超声提取重楼总皂苷[9-10]等，其中经典提取方法主要采用乙醇作为溶剂，采用加热回流或超声提取，亦有新方法如泡沫分离法、超高压技术等，能在一定程度增加重楼皂苷的浸出率，以达到有效成分的充分利用，如何高效的提取重楼总皂苷使其广泛应用成为研究重点。本实验以重楼总皂苷的提取率为评价指标，采用Box-Behnken效应面法对重楼总皂苷提取工艺进行系统优化研究，为其进一步研究及应用提供理论依据。然而，如何高效的提取重楼总皂苷使其广泛应用成为研究重点。本实验针对重楼总皂苷的提取率为研究对象，应用采用Design Expert 8.05软件对重楼总皂苷进行提取工艺优化研究，为其进一步研究及应用提供理论依据。

资料与方法

1 仪器与试药 RE-5003旋转蒸发仪；BSA323S电子天平；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵；安捷伦1200高效液相色谱系统。

重楼皂苷I对照品(批号：111591-200402，纯度>98%)，重楼皂苷Ⅱ对照品(批号：111590-200402，纯度>98%)；乙腈为分析纯。

2 方 法

2.1 色谱条件：采用Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱；以乙腈-水(40:60)为流动相；流速为1.0 ml/min；检测波长采用210 nm；进样量：20 μl。

2.2 提取工艺：重楼中重楼总皂苷的提取采用乙醇回流法。将重楼的干燥的根茎粉碎后过80目筛备用，精密称取5.0 g放入到乙醇中浸泡一段时间后进行回流提取，提取物经抽滤、减压浓缩，即得重楼的总皂苷浸膏。准确称取5.0 g已粉碎重楼干燥根及根茎粉末进行提取操作，参照“2.1”项下色谱方法及条件测定重楼总皂苷含量，根据公式计算重楼中重楼总皂苷的提取量。重楼总皂苷提取量(mg/g)= 总皂苷含量(mg)/原料重量(g)

2.3 Box-Behnken 响应面法提取重楼总皂苷工艺优化研究：在预实验的基础上，以提取乙醇浓度为40%(低)、60%(中)、80%(高)；提取液的液料比为10∶1(低)、15∶1(中)、20∶1(高)；重楼总皂苷提取时间为1 h(低)、2.5 h(中)、4 h(高)，以重楼总皂苷提取量(Y, mg/g)为评价指标，应用Box-Behnken响应面法对重楼中的重楼总皂苷进行提取工艺优化研究。

结 果

1 实验设计及统计分析 采用Box-Behnken响应面法对重楼中的重楼总皂苷进行提取工艺优化研究实验，设计表及结果，见表1。

表1 Box-Behnken实验设计表与效应值

2 数据处理及模型拟合 采用“Design Expert 8.05”软件，对各工艺参数下所得提取率进行数据处理，对各提取工艺参数对提取率进行多元线性回归和二项式方程拟合，结果见表2。从表2可知，回归方程中，X1(Pr=0.0481)、X2(Pr=0.0258)、X3(Pr=0.0361)、X12(Pr=0.0026)项显著，说明乙醇浓度的增加，重楼总皂苷提取量先增加后降低；随着液料比的增加，重楼总皂苷提取量呈现增加趋势；随着提取时间的延长，重楼总皂苷提取量呈现增加趋势。

表2 回归方程中系数的显著性检验

3 提取工艺参数验证 以重楼总皂苷提取量最大值为目标，最终优化后所得重楼总皂苷提取工艺为：提取乙醇浓度为62.5%、液料比为16.5、提取时间为3.0 h，模型预测值重楼总皂苷的提取量为5.74 mg/g。应用最终优化所得的工艺参数对3批重楼药材进行提取，并测定重楼总皂苷含量。结果表明，3批重楼总皂苷的平均提取量为(5.89±0.74)mg/g(n=3)，所优化模型的预测值与实测值的偏差为2.61%，结果表明优化结果及预测模型良好。

讨 论

星点设计作为一种药学研究中常用实验设计方法，根据星点设计建立的数学模型描绘效应面，从其较优区域可以直接读取较佳工艺条件，适应于具有连续特征变量因素水平的优化[11-12]。正交试验设计是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了"均匀分散，齐整可比"的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。与传统正交工艺优化相比，星点设计具有实验次数少、实验精度高、预测性较好的优势，并且能够灵敏地考察各个自变量之间的交互作用，进行各自变量的最优化，做出相应的三维因变量曲面图，并能从图形分析寻求最优实验考察因素，对自变量与因变量的关系进行直观的量化分析[13-14]。星点设计是国内外常用的实验设计优化方法，其结果可以集数学、统计学方法于一体，利用实验设计并通过实验得到一定数据，采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优处方，解决多变量问题。与正交实验方法比较，可以评价指标和因素间的非线性关系，使用方便，条件预测性较好。本实验通过采用Box-Behnken效应面对重楼中重楼总皂苷的提取工艺进行优化研究，得到了最佳提取工艺参数：浓度乙醇为62.5%、液药比例为16.5∶1、提取时间为3.0 h，经3批工艺验证，本研究重楼总皂苷的实际提取量与预测提取量二者的相对误差为2.61%，表明该筛选方法具有较高的可靠性。重楼皂苷极性较小，水溶性差，62.5%的醇较90%醇的穿透能力好，同时又具有一定的溶解性，因此可获得较高的提取效率，同时提取过程中需要对其进行粉碎处理，前期预实验提示，重楼总皂苷的提取率与其粉碎程度具有一定的相关性，由于药材经粉碎后可以加速皂苷的溶出，但过高的粉碎度反而不利于醇对其润湿，从而降低其提取效率，最终选用重楼粉碎后过80目筛为粉碎规格。皂苷类成分作为重楼主要有效成分，其含量直接决定了提取工艺的科学性，本研究在采用高效液相色谱法测定各皂苷含量基础上计算总皂苷含量，研究结果与以往文献的提取率相比，本研究确定的提取工艺参数所获得的重楼总皂苷提取率高于文献报道[15-16]。同时，确定采用的乙醇浓度有一定程度降低，在保证提取率基础上可节约提取成本。因此，响应面法优化重楼总皂苷提取工艺，所得结果可较好的拟合重楼总皂苷的提取，所得重楼总皂苷提取工艺参数具有提取效率高的优点，为进一步开发和利用重楼资源及重楼相关产品的开发提供了理论及现实依据。

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OptimizationoftheextractionofrhizomaparidistotalsaponinbyBox-Behnkeneffectsurfacemethod

Fan Shaomin，Shi Yajun，Zhang Xiaofei，et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objective：To optimize the extraction process of total saponins by Box-Behnken effect surface. Methods：The extraction rate of total saponins was determined by the regression method of ethanol concentration, extraction time and ratio of material to liquid, and the extraction rate of the tota saponin. And compared the predicted value with the observed value. Results：The optimum extraction parameters were as follows: the concentration of ethanol was 62.5%, the ratio of liquid to material was 16.5∶1, the extraction time was 3.0 h, the extraction parameters were obtained by three batches, and the extraction amount of total saponins The relative error between the predicted value and the regression model is 2.61%. Conclusions：The Box-Behnken effect surface method is used to optimize the extraction process of the total saponins in the re-building. The method is simple, the result is reliable and the prediction is good.

Rhizoma paridis Saponins Extraction Box-Behnken

*陕西省科技厅科技攻关计划项目(2015SF203)

△通讯作者

重楼 皂苷类 提取法 Box-Behnken

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.12.061

(收稿：2017-08-21)