嗅三针对阿尔茨海默病小鼠海马区磷酸化P38MAPK和TNF-α表达的影响*

王 渊，刘智斌，牛文民，王 强，李 杰，鲁 刚

陕西中医药大学(咸阳 712046)

嗅三针对阿尔茨海默病小鼠海马区磷酸化P38MAPK和TNF-α表达的影响*

王 渊，刘智斌△，牛文民，王 强，李 杰，鲁 刚

陕西中医药大学(咸阳 712046)

目的：观察嗅三针对阿尔茨海默病(AD)小鼠海马磷酸化P38MAPK和TNF-α表达的影响，以阐明其基于嗅觉通路治疗AD的作用机制。方法：将40只AD小鼠随机分为模型组、嗅神经切断嗅三针组、嗅三针组、盐酸多奈哌齐组，每组10只，另取10只同窝的阴性小鼠作为正常对照组。通过嗅三针对印堂穴和双侧迎香穴行电针刺激，每次10 min，以3 mg(kg·d)的剂量对盐酸多奈哌齐组AD小鼠进行灌胃，每周干预5次，间歇2 d，共干预4周。应用Western blot技术检测海马p-p38MAPK蛋白，免疫组化法检测TNF-α表达水平。结果：嗅三针刺激和盐酸多奈哌齐灌胃能够显著降低海马p-p38MAPK蛋白和TNF-α的表达，与AD模型组比较，差异具有显著性(P<0.05)。嗅神经切断嗅三针组对AD小鼠海马p-p38MAPK蛋白和TNF-α的表达均无明显影响，与AD模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，嗅三针组与盐酸多奈哌齐组比较无统计学差异(P>0.05)。结论：嗅三针具有调控P38MAPK通路，降低AD小鼠海马炎症因子TNF-α表达的作用，嗅觉通路的完整性可能是其发挥干预效应的核心机制。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以认知功能障碍为主要特征的神经退行性疾病。现代研究表明，β-淀粉样蛋白沉积，继而激活小胶质细胞(microglia,MG)，处于持续活化的状态MG不断地产生各种神经毒性物质和如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等致炎性因子，持续对于神经产生泛化式损伤，MG又可以被受损的神经元和神经毒性物质所激活引发神经毒性循环链的产生，加速AD的发展[1-2]。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)在MG的分化增殖、凋亡以及炎症反应等方面发挥重要的作用，其中P38MAPK是MAPK家族中经典的亚族通路之一[3-4]。多年以来，本研究团队应用“嗅三针”疗法治疗AD，疗效确切且优势明显。本研究拟观察嗅三针对保留和切断嗅觉通路的AD小鼠海马磷酸化P38MAPK和炎症因子TNF-α表达的影响，为嗅三针治疗AD提供理论依据。

材料和方法

1 实验动物和分组 实验动物购自南京大学模式动物研究所为批号：SCXK(宁)2016-003，体重(35.8±4.22)g，7个月龄的APP/PS1双转基因小鼠(AD模型小鼠)40只，随机分为4组，分别是AD模型组(model)、嗅三针组(XSZ)、嗅三针+嗅神经切断组(XSZ+XSJ)和盐酸多奈哌齐组(Donepezil)，每组10只，并同窝阴性小鼠10只作为正常对照组(sham)。嗅三针组以嗅三针电刺激对其进行干预；嗅三针+嗅神经切断组在切断AD小鼠嗅神经后对其进行嗅三针电刺激；盐酸多奈哌齐组以3 mg(kg·d)的盐酸多奈哌齐组对其进行灌胃；对模型组和正常组小鼠于每天同一时间进行相同程度的抓取，不做任何干预；以上干预方式对于各组小鼠均为1次/d，1个疗程为5 d，间歇2 d，共进行4个疗程。

2 主要试剂与仪器 抗TNF-α多克隆抗体(美国Neo-Markers公司)；兔抗鼠p-p38MAPK抗体(Santa Cruz公司)；兔抗鼠GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)； HANS-200A型韩氏穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司)，凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司)，JD801图像分析系统(江苏捷达科技公司)；华佗针灸针(规格0.25×13 mm，苏州医疗用品有限公司)。

3 嗅神经切断术 采用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)将AD小鼠进行麻醉，用脑立体定位仪将其固定，切开小鼠颅顶正中的皮肤并将其前囟小范围分离暴露，分别于鼻额缝、矢状静脉窦和眼眶上内侧缘之间，钻两个小孔深度至暴露嗅球，直径均为1 mm，以不使嗅球损伤为度，对于嗅球前端的硬脑膜，应用显微解剖镊将其提起，对于嗅神经采用锐性切断术，尽量避免使嗅球受到损伤，采用明胶海绵对相应部位进行压迫止血，将青、链霉素点于伤口处，最后对伤口进行缝合[5]。

4 嗅三针干预方法 嗅三针干预穴位取双侧迎香穴及印堂穴。迎香穴定位：小鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处；印堂穴定位：小鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点[6]。操作方法：迎香穴向内上方斜刺2 mm，印堂穴向鼻根部平刺2 mm；正极接印堂穴，负极接一侧迎香穴，刺激10 min；负极换接另测迎香穴，刺激10 min。刺激参数：疏密波，频率为2/15 HZ，强度为1 mA。

5 免疫蛋白印迹(Western blot)法检测小鼠海马区p-p38MAPK表达 干预结束后，采用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)将小鼠进行麻醉，将其海马组织快速取出并置于EP管，迅速放入液氮后，置于-80℃冰箱进行保存。WB检测步骤如下：将等量大小的海马样本剪取后放置于EP管中，再将RIPA蛋白裂解液(等体积预冷)加入每份样本之中，采用超声破碎仪对其研磨，接着在4℃的条件下采用1500 r/min的转速的高速冷冻离心机对其进行离心。对于各样本蛋白浓度采用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，将目标蛋白上样并电泳1 h后，转膜至PVDF膜上并进行封闭，之后将一抗兔抗鼠p-p38MAPK(1∶100)加入其中，在4℃的条件下孵育过夜，然后经二抗HRP-羊抗兔IgG(1∶100)，常温下孵育1 h，并进行TBST洗涤，显影采用ECL试剂盒，时间为5 min，将目标蛋白曝光完毕后，对于目标条带灰度值的计算采用凝胶成像分析系统。

6 免疫组化法检测小鼠海马区TNF-α的表达 操作步骤参照免疫组化试剂盒说明书进行。随机观察每张切片中5个高倍视野下的海马区域，采用生物医学图像分析系统对视野进行TNF-α灰度值测定并记录相应结果。

结 果

1 嗅三针对AD模型小鼠海马p-p38MAPK蛋白表达水平的影响 通过对小鼠海马区p-p38MAPK蛋白的检测，经统计学处理，我们发现，与正常对照组比较，模型组表达显著增高，具有统计学差异(P<0.01)；与模型组比较，嗅三针组表达显著降低(P<0.05)；与模型组比较，嗅三针+嗅神经切断组的表达没有统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组的表达显著降低(P<0.05)；嗅三针组与盐酸多奈哌齐组比较无统计学差异(P>0.05)，见图1，表1。

图1 各组小鼠海马p-p38MAPK蛋白表达的比较

表1 各组小鼠海马p-p38MAPK蛋白表达的比较

2 嗅三针对AD模型小鼠海马内TNF-α表达水平的影响 通过对小鼠海马区TNF-α表达的检测，经图像分析测试，我们发现TNF-α均表达于各组小鼠海马中。对于的TNF-α表达，与正常组比较，TNF-α平均灰度值在模型组中表达具有统计学意义的降低(P<0.01)，表明模型组海马TNF-α呈强阳性表达；与模型组比较，嗅三针组表达显著降低(P<0.05)；与模型组比较，嗅三针+嗅神经切断组表达没有显著性差异(P>0.05)；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组表达显著降低(P<0.05)；嗅三针组与盐酸多奈哌齐组比较无统计学差异(P>0.05)。

表2 各组小鼠海马内TNF-α平均灰度值的比较

讨 论

嗅觉系统的中枢神经位于大脑的梨状区皮质区域、杏仁核和颞叶，这与AD早期病变的发病区域重合率较高，具有明显的相关性，AD早期的主要临床症状以嗅觉功能障碍持续时间最长，目前尚未有终止或逆转AD发病进程的药物，故尽早确诊病例、对症治疗、延缓病情进展是目前治疗AD关注的焦点[7-8]。因此，如能在AD早期对嗅觉功能障碍进行干预，将有可能延缓AD发病进程。多年来，本研究团队一直致力于针刺治疗AD的临床及基础研究，在临床取得良好疗效。同时，在针刺干预神经退行性疾病引起的嗅觉功能障碍的实验研究(国家自然科学基金面上项目NO.30973792、NO.81674086)中也证实，“嗅三针”疗法(双侧迎香和印堂三穴，其主治均与嗅觉系统密切相关)可以通过嗅觉通路对神经退行性病变有良好的干预效应。鉴于此，为了进一步明确嗅三针对AD的调控机制，本研究拟通过切断和保留嗅觉通路，观察嗅三针对AD小鼠海马磷酸化P38MAPK和TNF-α表达的影响。

研究表明，MAPK途径与AD中Aβ的沉积密切相关，Aβ的沉积后MAPK激活，直接诱导MG活化[9-10]。此外，活化的MAPK还高效诱导多种炎症因子(IL-1β、TNF-α等)表达，这些因子又是MAPK的刺激剂，以正反馈机制进一步活化MAPK，使炎症反应被持续放大[11-12]。同时，这些炎症因子能显著促进MG活化，而MAPK是它们诱导MG活化的主要效应通道[13-14]。P38MAPK是MAPK家族三条经典的亚族通路之一，可由多种因素所激活并产生炎性介质，级联式的促使炎症反应的发生发展[15]。Aβ刺激MG产生TNF-α等细胞因子的释放，而TNF-α能够通过非依赖方式分别激活p38MAPK通路，从而诱导MG活化，导致炎症反应的泛化和持续，故抑制p38MAPK通路的激活，降低MG激活引发的炎性反应，是治疗AD的至关重要的途径之一。本研究发现，嗅三针干预AD小鼠的可能机制之一是通过降低p-p38MAPK表达抑制TNF-α的释放，减轻炎症反应的泛化和持续，而在嗅神经切断后，干预效应不显现。

综上所述，“嗅三针”的取穴定位完全基于中医药理论，鼻为嗅觉器官，嗅三针均临近鼻部，符合局部取穴原则，从现代解剖学角度来看，“嗅三针”通过血管、神经途径与嗅觉系统有密切关系。我们认为“嗅三针”基于嗅觉通路的完整性，能够降低AD小鼠海马磷酸化P38MAPK表达并发挥对炎症因子TNF-α抑制效应，这可能是嗅三针干预AD小鼠的机制之一，进一步证明嗅神经是 “嗅三针”发挥作用的神经通路。

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InfluenceofXiusanzhenonexpressionofphosphorylatedP38MARKandTNF-αinhippocamusofmicewithalzheimer’sdisease

Wang Yuan, Liu Zhibin,Niu Wenmin,et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objecticve：To observe the intervening effect of Xiusanzhen Electroacupuncture(EA) on phosphorylation of P38MAPK and TNF-α expression in hippocampus of mice with Alzheimer’s disease(AD), in order to clarify its therapeutic mechanism based on the olfactory nerve pathway in alleviating AD. Methods: 40 AD mice were randomly devided into 4 groups: AD model group, Xiusanzhen EA with olfactory nerve transected group (ONT+EA), Xiusanzhen EA group, Donepezil HCl group, with 10 mice respectively in each group, then took 10 negative mice as normal control group. Electroacupuncture intervention of Xiusanzhen was applied to stimulate bilateral LI 20 and EX-HN3 for 10min per time, intragastric administration of donepezil HCI in AD mice was performed at the dose of 3mg(kg·d),once daily intervention (except weekends) for 4 weeks in all. Western blot technique was applied to detect p-p38MAPK protein expression in hippocampus, immunohistochemical method was used to detect the expression level of TNF-α in hippocampus . Results Compared with AD model group, Xiusanzhen EA group Donepezil HCl group could reduce p-p38MAPK protein and TNF-α expression in hippocampus of AD mice, there were significant differences between the two groups (P<0.05).There were no significant differences were found between AD model and ONT+EA groups in influencing p-p38MAPK protein and TNF-α expression in hippocampus of AD mice (P>0.05). There were no significant difference between Xiusanzhen EA group and donepezil HCL group (P>0.05). Conclusion:Xiusanzhen EA can regulate expression of TNF-α through p38MAPK signaling pathway,the integrity of the olfactory pathway is the core mechanism of the intervention effect.

Alzheimer disease/acupuncture-moxibustion @Xiusanzhen Animal experimentation Mice

*国家自然科学基金资助项目(81503667) 陕西中医药大学重点培育科研基金(2015PY07)

△通讯作者

阿尔茨海默病/针灸疗法 @嗅三针 动物实验 小鼠

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.12.063

(收稿：2017-08-22)