真菌毒素DON和ZEN的体外联合毒性评价

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(1.宁波方太厨具有限公司,浙江宁波 315336; 2.天津顶育咨询有限公司食品安全中心,上海 201103; 3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122; 4.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

真菌毒素DON和ZEN的体外联合毒性评价

徐慧1,石慧2,张银志3,*,孙秀兰3,4,纪剑4,张入元4

(1.宁波方太厨具有限公司,浙江宁波 315336; 2.天津顶育咨询有限公司食品安全中心,上海 201103; 3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122; 4.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

选取BEL7402细胞对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的联合毒性进行评价。首先将不同浓度的DON、ZEN以及其混合物染毒对数期的BEL7402细胞,刺激24 h后,对细胞增殖率、ROS活性氧水平、钙离子水平、细胞凋亡率以及凋亡相关靶点基因的表达等指标进行监测分析,并对两种毒素的联合毒性作用进行评价。结果表明,真菌毒素DON、ZEN均可抑制细胞活性,IC50分别为9.3、27.2 μg/mL,可导致细胞氧化应激损伤,提高细胞内活性氧水平以及钙离子浓度,显著上调凋亡关键基因p53、Bax,下调Bal-2基因,诱导细胞产生早期凋亡甚至坏死,多种毒性指标验证了这两种毒素对细胞的联合毒性作用表现为加和作用。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇,玉米赤霉烯酮,联合毒性,体外毒性,加和作用

随着真菌毒素的危害在全球范围内受到广泛关注,并成为各国科学家研究的热点后,单种真菌毒素对人体和动物的毒性评价研究已经有大量的科技论文报道,而多种真菌毒素的共同作用则是最近才引起注意[1-2]。现实生活和环境相对复杂,从一些报道中可以发现,食品往往受到不止一种真菌毒素的污染[3-5],脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)都是由镰刀菌所产生的代谢产物,尤其是在南方多雨潮湿日照短的亚热带湿润气候地区,霉菌污染非常严重,DON和ZEN在饲料中的检出率达100%[6]。此外,现实环境中能够引起家畜出现不适或导致中毒症状所需要的单种真菌毒素的剂量,往往相较于动物实验研究所需要的剂量要低得多。这是由于摄入混合真菌毒素后,毒素之间会产生复杂的相互作用,且与染毒宿主、作用时间以及剂量等因素相关。关于相互作用效应并没有统一明确的定义,政府部门也没有发布关于毒素联合作用的相关法规[7]。相互作用的情况一般可以分类为:协同作用、加和作用、亚加和性效应以及拮抗作用[8]。由此可见,在真菌毒素混合污染普遍严重的情况下,除了对真菌毒素单独的毒性危害进行评价外,也要考虑多种真菌毒素联合毒性作用的危害评估[9]。本文通过对DON和ZEN单独以及联合染毒细胞后活性氧ROS的水平,钙离子通道,细胞凋亡率,凋亡靶点基因等指标的测定来研究其毒性以及联合作用,从细胞水平,离子水平,基因水平对两种真菌毒素的联合毒性作用进行了评价,为进行更多指标的深入研究提供了有用的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BEL7402人肝癌细胞 中国科学院细胞库;RPMI 1640培养基、胎牛血清、含0.25% EDTA的胰蛋白酶(250 U/mg) Gibco公司;脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品(DON,纯度≥99%)、玉米赤霉烯酮标准品(ZEN,纯度≥99%)、二甲基亚砜(DMSO) Sigma公司;活性氧(ROS)检测试剂盒、钙离子荧光探针试剂盒、细胞凋亡试剂盒 碧云天生物技术公司;Trizol试剂盒、DNA抽提试剂盒及RNA酶(酶活2 kU) 上海生物工程有限公司;PCR反应试剂 TaKaRa(大连)生物公司;实验中所用试剂 均由超纯水配制。

SW-CJ超净工作台 苏州零三净化设备有限公司;CO2恒温培养箱 美国Thermo Scientific公司;Universal32R冷冻离心机 德国Hettich公司;DT5-2低速离心机 北京时代北利离心机有限公司;Petroff-Hausser细胞计数器 上海上碧实验仪器有限公司;倒置式生物显微镜 日本Olympus公司;Infinite M1000酶标仪 瑞士Tecan;激光共聚焦显微镜 德国蔡司公司;流式细胞仪 美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 细胞常规培养:将BEL7402细胞利用含有10%胎牛血清和1%的100 μg/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养液,于饱和湿度5% CO2的37 ℃恒温培养箱中进行培养。BEL7402细胞为贴壁生长,每隔3 d更换培养液一次,当细胞覆盖瓶底面积90%时,可传代培养。传代时在超净台内酒精灯火焰前,小心打开待传代的细胞培养瓶盖,轻微灼烧瓶口和后盖,弃废液,PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)清洗2次,加入0.25%胰蛋白酶进行消化,于二氧化碳培养箱中孵育2 min,待细胞变圆细胞间出现间隙,立刻加入2 mL完全培养液终止消化,用灭菌吹打管轻轻吹打成细胞悬液,1000 r/min离心5 min,弃上清,用完全培养液重悬细胞,将其分装2瓶。

细胞冻存:选取对数生长期,生理状态良好的细胞,冻存前一天更换培养液。待细胞消化离心(条件与细胞培养相同)后,向离心管中加入2 mL细胞冻存液(10%的DMSO,20%的胎牛血清,70%的完全培养液)吹打重悬细胞后转移至冻存管,密封标注细胞名称和日期,将冻存管先后按4 ℃ 30 min,-20 ℃ 4 h,-80 ℃ 12 h保存后转移至液氮罐中长期保存。

复苏:将含有待复苏细胞的冻存管从液氮罐中取出,置于37 ℃温水中解冻直至冻存管中溶液全部融化,1000 r/min离心5 min弃上清,加入1 mL 新鲜培养液重悬,再次1000 r/min离心5 min弃上清,加入完全培养液重悬吹打均匀,转入培养瓶中,于饱和湿度5% CO2的37 ℃恒温培养箱中进行培养,24 h后换液弃除未正常贴壁生长的细胞继续培养。操作过程中应注意快速解冻,避免冰晶导致细胞组织损伤。

1.2.2 MTT实验 MTT法是常见的测定细胞增殖活性的实验,其原理是活细胞线粒体中的脱氢酶能够将黄色的四甲基偶氮唑盐(MTT)还原成蓝紫色的结晶化合物甲臜沉积于细胞中,而死细胞没有这种能力,甲臜可溶于二甲基亚飒(DMSO)中,通过酶标仪测定吸光值(OD值),OD值与活细胞数成正比,可间接反映活细胞的变化,进而推算出毒素对细胞的抑制率。取对数生长期的BEL7402细胞消化收集制成单细胞悬液,计数并调整细胞浓度,将细胞以5×103个/孔接种于96孔板中培养,待其贴壁小心吸除培养液,加入含有不同浓度的真菌毒素DON,ZEN及其联合组的培养液,控制终浓度分别为DON:0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL;ZEN:0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50μg/mL;联合染毒组DON+ZEN:0.1+0.1、0.2+0.2、0.5+0.5、1+1、2+5、5+10 μg/mL,每孔加入药液200 μL。对照组每孔加入等体积的含有0.1% DMSO的培养基,空白组不接种细胞只加入等体积培养液。实验组与对照组均设4个平行。将96孔板置于二氧化碳培养箱中孵育24 h后,弃上清，每孔加入100 μL浓度1 mg/mL的MTT溶液,继续培养4 h,用针管小心吸除上清,每孔加入150 μL的DMSO,振荡10 min,待孔中的紫色结晶完全溶解,用酶标仪在492 nm处测定各孔的吸光度(OD)值。计算增殖抑制率(%)=[1-(A染毒组-A空白组)/(A对照组-A空白组)](100[10],根据上述实验结果确定DON、ZEN单独染毒的半数抑制浓度(IC50),再根据IC50筛选出合适的DON、ZEN单独染毒及其联合染毒的浓度。

1.2.3 细胞内活性氧(ROS)水平的测定 实验通过活性氧试剂盒对细胞内活性氧进行检测,活性氧试剂盒的主要试剂成分为DCFH-DA探针,探针本身没有荧光,它可以透过细胞膜进入细胞后被水解为DCFH,DCFH无法穿透细胞膜,因而被滞留于细胞内,当细胞内活性氧水平升高时,DCFH被氧化为可以发荧光的DCF,通过流式细胞仪检测DCF的荧光强度,从而得出细胞内活性氧的含量。采用DCFH-DA荧光探针来检测细胞受真菌毒素刺激后体内活性氧的水平,实验按照活性氧检测剂盒说明书进行操作。将BEL7402细胞接种到六孔板中,使每孔的细胞浓度达到1×106个/mL,待细胞贴壁进入对数生长期后,加入含不同组合真菌毒素的完全培养液其中DON染毒浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL;ZEN染毒浓度为0.1、0.2、0.5、1、5、10 μg/mL;联合染毒组DON+ZEN:0.1+0.1、0.2+0.2、0.5+0.5、1+1、2+5、5+10 μg/mL,阴性对照组为含有0.1% DMSO的RPMI 1640培养基,阳性对照组是终浓度为50 μmol/L H2O2的RPMI 1640培养基,每个实验组3个平行,于二氧化碳培养箱中孵育24 h,弃除培养液用PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)离心洗涤并吹悬,加入终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA混匀,37 ℃避光孵育30 min,每10 min摇匀一次,以促使探针和细胞充分结合。最后用无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞两次,流式细胞仪测定其平均荧光强度(激发波长488 nm,发射波长530 nm)。

表1 基因的引物序列及退火温度Table 1 Sequence of the peimers and annealing temperature

1.2.4 细胞内Ca2+浓度的测定 选用Fluo-3 AM作为监测细胞内钙离子浓度的荧光探针,将BEL-7402细胞铺于六孔板,每孔细胞浓度达到1×106个/mL,待细胞贴壁生长进入对数生长期后开始加入与上述1.2.2相同含有不同组合真菌毒素的完全培养基染毒培养24 h,1000 r/min离心5 min,后用PBS洗涤3次,加入含有浓度为1 μmol/L Fluo-3 AM染液的培养基,混匀,于二氧化碳培养箱中避光孵育30 min,利用激光共聚焦显微镜测定其平均荧光强度(激发波长488 nm,发射波长525 nm)。

1.2.5 细胞凋亡率的测定 采用Annexin V-FITC和碘化丙啶PI双染法对细胞进行染色,并于流式细胞仪上检测细胞凋亡率,将呈对数生长的BEL7402细胞铺于六孔板中,待细胞贴壁后,加入与上述1.2.2相同的含有不同组合真菌毒素的培养液孵育24 h,弃除培养基,用预冷的PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)洗涤2次,加入胰酶消化细胞,2 min后加入细胞培养液终止消化,收集细胞,1000 r/min离心5 min,弃上清液,先加入500 μL Binding Buffer轻轻重悬细胞后,加入5 μL Annexin V-FITC染色液,轻轻混匀,再加入5 μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀,于冰浴避光孵育10 min,随即利用流式细胞仪检测,Annexin V-FITC经FL1通道检测,最大激发波长488 nm;最大发射波长530 nm,PI经FL3通道检测,最大激发波长为535 nm,最大发射波长为615 nm,采用Cell Quest软件对检测结果进行分析。此外,为了使得凋亡检测变得更加直观,将转染后的细胞用胰蛋白酶消化后以调整细胞数以1×105个/mL接种于激光共聚焦培养皿中,待贴壁后,吸除培养液,加入500 μL的含有5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide的Binding Buffer轻轻混匀,避光孵育10 min,真菌毒素刺激组作为实验组,未刺激组作为阴性对照组,采用激光共聚焦显微镜对BEL7402细胞进行观察和分析。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测基因mRNA水平 将不同浓度真菌毒素染毒后的细胞,用Trizol法抽提细胞中的总mRNA,于260 nm及280 nm处测定吸光度值,计算mRNA的纯度。计算公式为:mRNA纯度=A260 nm/(A280 nm-本底),确保mRNA纯度在1.8～2.0之间。按反转录试剂说明书,配制10 μL反应体系,反转录条件为37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃冷却。按实时定量PCR试剂盒说明书配制成20 μL反应体系。用荧光定量PCR仪检测基因表达强度Ct值,按-ΔΔCt方法计算[11]。上下游引物和内参引物序列如表1所示。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 DON、ZEN分别对BEL7402细胞增殖活性的影响

本实验采用不同浓度水平的DON、ZEN单独染毒BEL-7402细胞,随着真菌毒素刺激浓度的不断升高,毒素对细胞的抑制率越来越明显,在DON染毒浓度范围低于0.5 μg/mL内,抑制率在5%左右,当染毒浓度超过10 μg/mL,细胞抑制率达到50%以上。ZEN在低浓度染毒范围内,细胞抑制率相对DON更小,当染毒浓度到达25 μg/mL时,抑制率接近50%,通过改良寇氏法计算出DON和ZEN的IC50分别为9.3、27.2 μg/mL。而在联合毒性细胞抑制率研究实验中,细胞抑制率达到50%的时候,DON浓度为2.5 μg/mL,ZEN浓度为7.5 μg/mL,相比于单一毒素组IC50的毒素剂量,真菌毒素DON和ZEN在本实验浓度设置叠加范围内,表现出一定程度的加和作用,为后续联合毒性实验选择合适DON和ZEN的组合浓度奠定基础。

图2 DON、ZEN单独及其联合作用对BEL-7402细胞活性氧的影响流式细胞仪检测图(A)和细胞内活性氧相对荧光强度值(B)Fig.2 Effects of DON ZEN and their combination on the interacellular ROS production of BEL-7402 cells detceted by flow cytometry(A),and relative fluorescenceintensity of interacellular ROS production(B)

图1 DON、ZEN以及DON+ZEN对BEL7402细胞活性影响Fig.1 Effects of DON,ZEN,and DON+ZEN on the BEL-7402 cell viability注:A:DON对BEL7402细胞的抑制率,B:ZEN对BEL7402细胞的抑制率,C:DON+ZEN对BEL7402细胞的抑制率。

2.2 DON、ZEN单独及其联合作用对BEL7402细胞活性氧的影响

由图2可见,随着DON、ZEN单独和联合刺激组的浓度不断增大,细胞内ROS不断增加,除低浓度组0.1 μg/mL外,各毒素刺激作用组的ROS显著高于对照组(p<0.05),DON、ZEN单独以及联合染毒刺激组的组间差异显著(p<0.05)。相比于DON在诱导细胞产生ROS方面,ZEN的作用幅度更大,可能与其各自的毒性作用机制相关。DON、ZEN联合刺激组的ROS值分别大于相应的单独刺激组,预测值和测得值之间无显著性差异(p>0.05),DON和ZEN联合作用对细胞内ROS的影响为加和效应。

2.3 DON、ZEN单独及联合染毒对细胞内[Ca2+]i的影响

图3 DON、ZEN单独及其联合作用对BEL-7402细胞内钙离子的影响的共聚焦成像图(A)和细胞内钙离子相对荧光强度值(B)Fig.3 Effects of DON ZEN and their combination on the interacellular[Ca2+]i of BEL-7402 cells detceted by CLSM(A)and Relative fluorescence intensity of interacellular[Ca2+]i(B)

图4 DON、ZEN单独及其联合作用对BEL7402细胞凋亡率影响的流式细胞图以及共聚焦成像图(A)和细胞凋亡百分比(B)Fig.4 Effects of DON ZEN and their combination on the apoptosis rate of BEL7402 cells detceted by flow cytometry and CLSM(A),and the percentage of apoptosis rate(B)

Ca2+作为一个主要的细胞内信使参与调控多种细胞生理活动,细胞内Ca2+稳态主要靠胞内钙池钙释放与重储来维持,有赖于Ca2+-ATP酶(钙泵)的Ca2+外流以及Ca2+跨膜内流,一旦这种稳态机制的被破坏失调就会产生一系列反应,随之就会导致细胞损伤或死亡[14]。在正常生理状态下,细胞内钙离子浓度总保持在极低水平,如图3A所示,对照组显示出微弱的荧光,而当细胞遇到相应刺激时,会通过多种途径提高细胞内钙离子浓度。利用DON、ZEN单独及联合刺激细胞后,细胞的荧光强度明显增强,表明真菌毒素能够使细胞钙稳态失调导致细胞内钙离子升高。由图3B可见,DON、ZEN单独或联合染毒24 h,BEL-7402细胞[Ca2+]i含量随毒素浓度的升高而增加,除0.1 μg/mL外各染毒组均显著高于空白对照组(p<0.05)。联合组的[Ca2+]i平均值分别均明显大于相对应的单独染的[Ca2+]i平均值,预测值和测得值之间无显著性差异(p>0.05),DON和ZEN联合染毒对细胞内[Ca2+]i蓄积为加和效应。此外,Ca2+水平的升高和ROS水平的提高相关,有研究表明ROS可以从多方面调节细胞内钙信号,ROS可以导致钙离子从细胞外环境向细胞质的内流,细胞质内钙离子的升高可以激活其他一些酶,从而进一步增加氧化自由基的产生。这也验证了之前实验组真菌毒素刺激BEL7402细胞后,细胞内ROS水平提高的现象。

2.4 DON、ZEN单独及联合染毒对细胞凋亡率的影响

流式细胞仪检测之后,如图4A(a)所示,图中左下角为正常活细胞,不被荧光染料染色;图中右下角为凋亡早期的细胞,为Annexin V-FITC染色;图中右上角为坏死细胞和凋亡晚期的细胞,同时被Annexin V-FITC和PI染色;图中左上角出现的细胞是许可范围内的检测误差,其中凋亡率的计算为:(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数。

DON、ZEN及其联合组染毒BEL-7402细胞24 h后,流式细胞仪检测其凋亡情况如图4B可见,对照组在没有真菌毒素刺激的条件下,细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率都很小,但使用DON、ZEN单独及其联合组分别刺激细胞后,细胞凋亡率均随毒素浓度的升高而增加。相比于对照组,DON单独染毒时,细胞凋亡率除0.1 μg/mL组差异不显著外,其余各组的细胞凋亡率均差异显著,组间差异显著(p<0.05)。ZEN单独染毒时,低浓度组(0.1、0.2 μg/mL)细胞凋亡率差异不显著,其余各高浓度组间细胞凋亡率差异显著(p<0.05)。其中,DON处理组的凋亡率比ZEN处理组的凋亡率高,DON和ZEN联合染毒24 h,细胞凋亡率组间差异显著(p<0.05)且分别都大于相对应的单独染毒组,预测值和测得值之间无显著性差异(p>0.05),DON和ZEN联合染毒对细胞凋亡率的影响为加和效应。此外,通过激光共聚焦显微镜对DON、ZEN以及其联合染毒细胞后的荧光水平进行直观观察,由图4A(b)可见,染毒组的绿色荧光和红色荧光强度均强于对照组,联合染毒组的红绿荧光强度要强于所对应的单独染毒组。

2.5 DON、ZEN单独及联合染毒对细胞内凋亡调控基因Bax、Bal-2及p53的mRNA表达的影响

2.5.1Bax、Bal-2基因mRNA表达影响 细胞发生凋亡的过程受到基因的严格调控,其中Bcl-2家族基因是与细胞凋亡相关基因中最受关注的之一。Bcl-2家族蛋白在调节线粒体凋亡途径中起着至关重要的作用,Bcl-2蛋白主要分布于线粒体膜、核膜及内质网膜上,维护线粒体膜完整,防止细胞色素C的释放,阻止细胞凋亡,是细胞的抗凋亡成员[15]。Bcl-2家族除Bcl-2外,还有Bax,当Bax形成Bax-Bax同源二聚体时会诱导细胞凋亡,随着Bcl-2表达量的上升,Bax二聚体会渐渐分开与Bcl-2形成比Bax-Bax二聚体更稳定的Bax-Bcl-2异二聚体,从而缓解Bax-Bax二聚体诱导细胞凋亡的作用,简言之,Bcl-2过量表达细胞存活,Bax过量表达则细胞凋亡[16]。由图5可见,DON、ZEN单独及其联合均可以上调Bax基因相对mRNA的表达。DON单独染毒BEL-7402细胞时,低浓度组0.1 μg/mL与对照组,0.2 μg/mL与0.5 μg/mL组间差异不显著,随着染毒浓度增大,Bax相对mRNA表达水平升高,后三组显著高于前三组(p<0.05)。ZEN单独染毒时低浓度组0.1 μg/mL与对照组不显著性,0.5 μg/mL与1 μg/mL组间差异不明显。联合染毒时各组差异显著,5+10 μg/mL显著性低于2+5 μg/mL,说明联合浓度达到DON 5 μg/mL+ZEN 10 μg/mL反而降低了Bax的mRNA的表达,DON、ZEN单独染毒或联合染毒的其余各组差异显著(p<0.05)。实验结果表明,DON和ZEN均可诱导BEL-7402细胞的Bax基因的表达,两者联合染毒时细胞内Bax的mRNA的表达量大于DON、ZEN单独染毒组,表现出加和效应。

图5 DON ZEN单独及其联合对BEL7402细胞Bax的mRNA表达水平Fig.5 Effects of DON ZEN and their combination on the relative mRNA level of Bax in BEL7402 cells注:对所有毒素剂量组分别与空白组进行 t-test检验,*表示p<0.05;图6、图7同。

由图6可见,DON、ZEN单独及其联合均可以下调Bcl-2基因相对mRNA的表达。DON单独染毒时,低浓度组0.1 μg/mL与对照组差异不显著,随着染毒浓度的增大,对Bcl-2基因下调越加明显;ZEN单独染毒时0.1 μg/mL组与对照组差异不显著;联合染毒时0.2+0.2 μg/mL、0.5+0.5 μg/mL组两个组间差异不显著。DON、ZEN单独染毒或联合染毒的其余各组差异显著(p<0.05)。实验结果表明DON和ZEN在较高浓度范围可以诱导Bal-2基因的下调,两者联合染毒时对Bal-2下调表现为加和作用。

图6 DON ZEN单独及其联合对BEL7402细胞Bcl-2的mRNA表达水平Fig.6 Effects of DON ZEN and their combination on the relative mRNA level of Bcl-2 in BEL7402 cells

图7 DON和ZEN单独及联合作用对BEL7402细胞p53相对mRNA表达水平的影响Fig.7 Effects of individual and combinational treatment of DON and ZEN on the relative mRNA ration of p53 in BEL7402 cells

2.5.2p53基因mRNA表达的影响 在细胞凋亡过程中,p53发挥着极其重要的作用。p53蛋白主要集中在细胞核浆中,能够和DNA发生特异结合,具有明显的细胞转化抑制作用,检查DNA损伤,监视基因组DNA的完整性。若遭受外界刺激导致DNA发生损伤,p53可作为转录因子诱导一系列下游基因的表达,介导细胞停止在G期,使损伤DNA得以充分修复。如果DNA遭受不可逆的严重损伤无法修复,则p53启动凋亡程序诱导细胞凋亡[17]。由图7可见,DON、ZEN单独及其联合均可以上调p53基因相对mRNA的表达。DON染毒BEL-7402细胞时,低浓度范围(<0.5 μg/mL)与对照组相比p53基因上调并不明显,随着染毒浓度的增大p53上调幅度有所增大。相对于ZEN来说,高剂量的DON上调p53幅度更大。ZEN染毒BEL-7402细胞时,低浓度范围(<1 μg/mL),p53相对mRNA表达水平较空白组随具有统计学显著性,但是上调趋势不够明显,刺激浓度增大,p53相对mRNA表达水平大幅度增加,当ZEN浓度达到5 μg/mL后,p53相对mRNA表达水平不再增加。DON、ZEN联合染毒的所有组较对照组都存在统计学显著性差异(p<0.05)。实验结果表明,DON、ZEN均能够诱导BEL-7402细胞的p53基因mRNA的表达,干扰p53凋亡通路的调控,从而诱使细胞发生凋亡。在两者联合诱导p53活化的程度均大于相应DON和ZEN单独染毒组,且测量值与预测值之间无显著性差异,对调控p53基因诱导凋亡表现为加和作用。

3 结论

通过对DON和ZEN单独以及联合染毒细胞后活性氧ROS的水平,钙离子通道,细胞凋亡率,凋亡靶点基因等指标的测定来研究其毒性以及联合作用。实验结果表明,DON和ZEN均可导致细胞氧化应激损伤,提高细胞内活性氧水平以及钙离子浓度,显著上调凋亡关键基因p53,Bax下调Bal-2基因,诱导细胞产生早期凋亡甚至坏死,多种毒性指标验证了这两种毒素作用细胞具有相似的作用位点和信号通路使其产生具有加和作用的联合毒性作用。

现阶段文献报道,大多通过细胞的存活率单一指标来计算真菌毒素DON和ZEN的联合效应,如,Kouadio J H 等人发现,DON(10～20 μg/mL)和ZEN(10-20 μg/mL)作用Caco-2细胞72 h之后,通过细胞存活率计算发表DON和ZEN存在加和作用[18]。Ficheux A S 等人发现,DON(0.04-0.1 μg/mL)和ZEN(0.2-10 μg/mL)作用CGU-GM 细胞14 d之后,通过细胞存活率计算发表DON和ZEN存在加和作用[19]。Wan L Y M 等人发现,DON(0.5-2 μg/mL)和ZEN(10-40 μg/mL)作用IPEC-J2 细胞48 h之后,通过细胞存活率计算发表DON和ZEN在低剂量下存在拮抗作用,在高剂量下存在协同作用[20]。而此次研究从细胞水平,离子水平,基因水平对两种真菌毒素的联合毒性作用进行了评价,为进行更多指标的深入研究提供了有用的参考价值。

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CombinativetoxicityassessmentofmycotoxinsDONandZENinvitro

XUHui1,SHIHui2,ZHANGYin-zhi3,*,SUNXiu-lan3,4,JIJian4,ZHANGRu-yuan4

(1.Ningbo Fotile Kitchen Ware Co.,Ltd.,Ningbo 315336,China;2.Tingyi Holding Corp,Central Research Institute-Food Safety,Shanghai 201103,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;4.School of Food Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

BEL-7402 cells were chosen as the cell model in this study to evaluate the indiviual and combined toxicity of Deoxynivalenol(DON)and Zearalenone(ZEN). With the logarithmic phase of BEL7402 cells exposed to different concentrations of DON,ZEN and their mixture for 24 h,the rate of cell proliferation,reactive oxygen species(ROS)and calcium levels,cell apoptosis rate and apoptosis related genes expression were analyzed and the combined effect of the two toxins was evaluated. The results showed that the mycotoxin DON,ZEN could inhibit cell activity with an IC50of 9.3 μg/mL and 27.2 μg/mL,lead to cell damage induced by oxidative stress and increase the intracellular levels of reactive oxygen species and calcium ion concentration. Proapoptotic genep53 was signifigantly up-regulation andBal-2 gene was down-regulated,induce cell apoptosis or necrosis,a variety of toxic index verified that the combined toxicity of these two toxins on cells have an additive effect.

deoxynivalenol;zearalenone;combined toxicity;invitrotoxicity;additive effect

2017-06-16

徐慧(1973-)，女，本科，工程师，主要从事家用电器机械制造方面的研究，E-mail:xuh@fotile.com。

*通讯作者:张银志(1975-)，男，硕士，高级工程师，主要从事食品安全检测方面研究，E-mail:yinzhizhang@jiangnan.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0268-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.049