复合酶法提取云芝多糖及其抗氧化活性

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(大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116600)

复合酶法提取云芝多糖及其抗氧化活性

杨佳琦,冮洁*,冀春阳,朱淑珍,王绍嘉,毛亚明,林杉

(大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116600)

云芝多糖,酶解法,提取条件,响应面法,抗氧化活性

云芝(Coriolusversicolor),隶属于真菌门担子菌纲,是一种药用真菌,又名彩绒革盖菌、云芝蘑等。云芝具有抗肿瘤、免疫调节、镇痛、消炎保肝、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化以及抗衰老等作用[1-5],是我国满族医药中的一种特色药材。著名的满药“复方木鸡颗粒”是以云芝为主药的制剂,具有治疗肝炎、肝纤维化、肝癌的作用。近年来人们对云芝的开发研究日益活跃,云芝逐渐成为中药开发的研究热点之一。

云芝多糖是云芝菌中重要的活性成分之一,目前云芝多糖远无法满足市场需求,一个重要原因是其提取得率较低,存在成本高、效益低、生产工艺复杂的问题[6]。云芝多糖的提取方法大多采用传统的热水浸提法[7],此方法因为有操作简单、条件易满足的优点而被广泛的应用,但是其最大的缺点就是云芝多糖得率相对较低。研究表明采用超声波提取法[8]、酶超声波联用提取法[9]、热水浸提醇沉结合纳滤膜法[10]、微滤超滤新工艺[11]等提取方法,可以提高云芝多糖的提取率。然而上述超声波和超滤等提取方法要求设备复杂,较难实现工业化。采用酶解法辅助提取云芝多糖,不仅可以提高云芝多糖的得率,而且设备简单,比较容易实现工业化。本文采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶复合酶解法辅助提取云芝多糖,通过响应面法对复合酶提取条件进行了优化,并对酶法提取的云芝多糖抗氧化活性进行了研究,为云芝多糖的提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云芝 产自吉林省长白山地区;木瓜蛋白酶 江苏锐阳生物技术有限公司,活力:80000 U/g;纤维素酶 江苏锐阳生物技术有限公司,活力:50000 U/g;果胶酶 江苏锐阳生物技术有限公司,活力:100000 U/g;苯酚、浓硫酸、无水乙醇、柠檬酸、无水乙酸钠、Tris-HCL溶液、硫酸亚铁铵溶液、邻二氮菲、过氧化氢、邻苯三酚、盐酸 均为分析纯或化学纯。

PL20电子精密天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;HH-S水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂;UV-2800紫外分光光度计 龙尼柯(上海)仪器有限公司;中药粉碎机 宁波新芝有限公司;旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;循环水式真空泵 巩义市华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 云芝多糖的传统热水浸提法 提取工艺流程为:云芝→烘干→磨粉→称取粉末2 g→热水浸提(提取温度80 ℃，时间5 h,料液比1∶30)→多糖浸提液→去杂蛋白→乙醇沉淀→检测多糖含量[12]。

1.2.2 云芝多糖的酶法提取 挑选优质干燥的云芝,放入粉碎机中进行粉碎,粉碎后的云芝过60目筛,精确称取5.0 g,按照料液比1∶30 (g/mL)加入150 mL的去离子水,按照设定的酶解条件(pH、酶解温度、酶解时间、酶浓度)进行复合酶解实验,复合酶比例为:木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶=1∶1∶1,然后在85 ℃的水浴锅中浸提100 min,得到多糖浸提液,多糖浸提液经过滤得到多糖上清液,测定多糖含量。

1.2.3 多糖含量的测定 多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[13]。

多糖得率(%)=提取的多糖量(g)/提取的物料量(g)×100

1.2.4 多糖提取单因素实验 准确称取粉碎样品5.0 g,置于三角瓶中,按照料液比1∶30 (g/mL),加入150 mL的去离子水,将复合酶[14]的条件定为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的比例为1∶1∶1,分别考察不同酶浓度(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、不同酶解时间(10、20、30、40、50 min)和不同酶解温度(25、35、45、55、65 ℃)对云芝多糖得率的影响[15-17],其中各因子固定水平为酶浓度2.0%、pH4.5、酶解时间30 min、酶解温度45 ℃。

1.2.5 云芝多糖复合酶解条件优化响应面实验 在单因素实验的基础上,将酶浓度、pH、酶解时间和酶解温度为自变量,根据Box-Behnken设计原理,将多糖得率作为响应值,利用Design Expert 8.05软件对数据进行分析,响应面设计的四因素三水平如表1所示。

表1 云芝多糖提取响应面法优化实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis for Coriolus versicolor polysaccharides extraction

1.2.6 云芝多糖的抗氧化活性

1.2.6.1 清除羟自由基(·OH)活性实验 取十支10 mL刻度管,均依次加入1 mL的Tris-HCl溶液(pH8.20),0.3 mL硫酸亚铁铵(5 mmol/L)和0.3 mL的邻二氮菲溶液(7.5 mmol/L),1号和2号试管不加样品,3～6号加入1 mL浓度分别0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的云芝多糖溶液,7～10号加入浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的VC溶液,1号试管不加入H2O2(7.5 mmol/L),2～10号试管加入H2O2。定容至刻度,在37 ℃的水浴锅中反应1 h,用Tris-HCl溶液调零,在510 nm下测吸光度A,计算对·OH的清除率[18]。VC做阳性对照,将实验重复3次,求平均值。 ·OH清除率计算公式为:

·OH清除率(%)=(A3-A2)/(A1-A2)×100

式中,A1为体系不加H2O2和多糖(抗氧化剂)的吸光值;A2为体系加H2O2而不加多糖(抗氧化剂)以后的吸光值;A3为体系加入H2O2和多糖(抗氧化剂)后的吸光值。

式中,Ao为体系未加多糖溶液(抗氧化剂)的吸光值;Ai为体系加入多糖溶液(抗氧化剂)的吸光值。

1.2.6.3 清除DPPH·效果的测定 取9个试管,1号为空白试管,加入2 mL无水乙醇和2 mL DPPH溶液。2～5号试管分别加入2 mL浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的云芝多糖溶液,四个试管都加入2 mL的DPPH,反应0.5 h后在517 nm处测吸光值Ai。6～9号试管分别加入2 mL浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL的云芝多糖溶液,四个试管都加入2 mL的无水乙醇,反应0.5 h后在517 nm处测吸光值Aj。VC做阳性对照。将实验重复3次,求平均值。

DPPH自由基清除率[20]计算公式为:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/Ac×100

式中,Ai为体系加入DPPH和多糖溶液(抗氧化剂)的吸光值;Aj为体系加入多糖溶液而未加DPPH的吸光值;Ac为体系不加入多糖溶液的吸光值。

1.3 数据处理

利用SPSS 19统计软件进行实验数据分析,所做实验均为三个平行样品,取平均值,实验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 热水浸提法对云芝多糖的提取

当不加酶液,用传统热水浸提法提取云芝多糖时,平均多糖得率为6.67%。

2.2 单因素对云芝多糖得率的影响

2.2.1 酶浓度对多糖得率的影响 由图1可知,当酶浓度增加到2%时,多糖得率达到8.73%,随着酶浓度的进一步增加,多糖的提取率并没有增加,说明在该底物浓度下,酶浓度已经趋于饱和,若继续添加复合酶,对多糖的提取率没有显著的影响。因此,酶浓度初步选定为2%。

图1 酶浓度对云芝多糖得率的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

2.2.2 酶解时间对多糖得率的影响 当酶作用时间为40 min时,酶与底物得到充分反应,此时云芝多糖的提取率最高。当提取时间大于40 min后,多糖得率变化趋于平缓,酶解时间过长,酶的催化活性下降,进而对多糖得率影响不大。因此,最佳酶解时间选定为40 min。

图2 酶解时间对云芝多糖得率的影响Fig.2 Effect of enzymlysis time on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

2.2.3 酶解pH对多糖得率的影响 如图3所示,当pH为3.5时,云芝多糖的提取率最低,溶液的酸度过大抑制了酶的活性;当pH为5.0时,云芝多糖得率达到9.74%,之后,随着pH增大,多糖的得率反而减小,这是因为pH的升高影响了酶与底物的亲和力,破坏了酶的活性,从而造成了多糖得率的下降。因此,pH为5.0时最佳。

图3 pH对云芝多糖得率的影响Fig.3 Effect of pH on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

图4 酶解温度对云芝多糖得率的影响Fig.4 Effect of enzymlysis temperature on the extraction yield of Coriolus versicolor polysaccharides

2.2.4 酶解温度对多糖得率的影响 酶作用温度对云芝多糖的提取影响如图4所示,在 45 ℃之前,随温度的升高,多糖得率不断增加,在45 ℃时提取率达到最大,然后从 45～65 ℃提取率缓慢下降,可能是由于温度过高,酶的活性降低,云芝多糖的提取率下降。因此,选择复合酶作用温度为45 ℃。

2.3 云芝多糖复合酶提取的响应面优化实验

2.3.1 采用响应面法优化云芝多糖复合酶法提取条件 在单因素实验结果的基础上,以酶浓度、pH、酶解时间和酶解温度4个因素为自变量,以云芝多糖得率为响应值,采用响应面法进行四因素三水平的实验设计,共包括29组实验方案。实验方案及实验结果见表2,方差分析见表3。

表2 云芝多糖提取的响应面实验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface design for Coriolus versicolor polysaccharides extraction

表2中实验1～24为析因实验,25～29为中心实验。29个实验点分为析因点和零点,其中析因点为自变量取值在A、B、C、D所构成的三维顶点,零点为区域的中心点,零点实验重复5次,用以估计实验误差。采用SAS RSREG程序对所得数据进行ANOVA分析,方差分析结果见表3。

表3 云芝多糖提取的响应面实验结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface design of Coriolus versicolor polysaccharides extraction

注:*:差异显著(p<0.05);**:差异极显著(p<0.01)。

对表2中的数据进行多元回归拟合,得到云芝多糖得率对编码自变量酶浓度、pH、酶解温度和酶解时间的二次多项回归方程:Y=9.71-0.23A+0.50B+0.65C+0.61D-0.14AB-0.38AC+0.12AD+0.50BC+0.52BD+0.21CD-0.94A2-1.18B2-0.66C2-1.08D2

对模型进行方差分析(表3),可以看出:p模型=0.024<0.05,表明模型显著;多糖得率失拟项p=0.4674,表明失拟不显著,所选用的二次回归模型是适当的;对模型进行回归方程系数显著性检验,得到模型一次项A差异显著(p<0.05),一次项B、C、D差异极显著(p<0.01),表明酶浓度、酶解温度、pH、酶解时间对多糖得率均有显著影响。由方差分析F值可知,4 个因素在实验过程对实验的影响顺序为:C>D>B>A,即pH>酶浓度>酶解温度>酶解时间。

2.3.2 云芝多糖的响应面分析 利用Design-Expert 8.05软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合,所得到的二次回归方程的响应面图如图5所示。图5直观地给出了各个因子交互作用的响应面的3D和等值线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出,在所选的范围内存在极值,既是响应面的最高点,同时也是等值线最小椭圆的中心点。图5中表明,B、C 的交互作用较强。在编码值5.0以上的C在B很大的范围内都能够得到较大的响应值,因子B(温度)对响应值的影响很大,这与ANOVA分析相吻合。A(时间)和C(pH),C(pH)和D(酶浓度)等值线近似圆形,可以知道它们之间的相互作用对云芝多糖得率的影响很小。同时,B(温度)和A(时间)、B(温度)和D(酶浓度)、D(酶浓度)和A(时间)等因素等值线相对扁平,说明两两之间的相互作用强,对云芝多糖的提取率有显著影响。

图5 酶浓度、酶解时间、pH和酶解温度对云芝多糖得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of effects of enzyme concentration,enzymlysis time,pH and enzymlysis temperature on the extraction rate of Coriolus versicolor polysaccharides

2.3.3 验证实验 为了进一步验证计算机拟合出得到最佳条件的值,回归方程求解,即当云芝多糖得率达到最大值时的提取条件为:酶解时间为36.93 min,提取温度为51.64 ℃,pH为5.50,酶浓度为2.50%。为方便实际操作将实验条件定为:酶解时间37 min,提取温度52 ℃,pH5.50,酶浓度2.50%。在上述最佳提取工艺参数下,进行3 组平行实验,所得多糖得率的平均值为9.58%,与回归方程所得的多糖得率9.87%,相对误差为3.03%。说明回归方程能较真实地反应各因素对云芝多糖得率的影响,证明用响应面法优化云芝多糖得率回归模型较可靠,响应面法对云芝多糖浸提条件的优化是可行的,得到的复合酶法辅助提取云芝多糖的提取条件具有实际应用价值。

2.4 云芝多糖的抗氧化活性实验

2.4.1 云芝多糖对羟自由基(·OH)的清除作用 由图6可知,云芝多糖对羟自由基均具有一定的清除作用。当云芝多糖浓度在0.1～0.5 mg/mL时,清除率趋于稳定的上升,当浓度接近0.7 mg/mL时,云芝多糖对羟自由基的清除率就趋于平稳。当质量浓度为0.7 mg/mL时,维生素 C 对羟基自由基清除率达到 72.42%,而云芝多糖对羟基自由基清除率为43.80%;因此云芝多糖与VC相比清除能力较弱,云芝多糖清除(·OH)的IC50为0.80 mg/mL,VC的IC50为0.33 mg/mL,云芝多糖具有较好的清除(·OH)的能力[21-22]。

图6 云芝多糖对羟自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of Coriolus versicolor polysaccharides on hydroxyl radical

图7 云芝多糖对超氧阴离子的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Coriolus versicolor polysaccharide on superoxide anion

2.4.3 云芝多糖对DPPH自由基的清除作用 由图8可知,随着质量浓度的增加,云芝多糖溶液和VC对DPPH自由基清除率不断增大,云芝多糖质量浓度0.7 mg/mL时,样品溶液多糖对DPPH自由基清除率达到47.3%,具有较强清除DPPH自由基的能力,而VC在质量浓度为0.7 mg/mL,对DPPH自由基清除率达到了91.7%,清除DPPH自由基的能力强于云芝多糖。云芝多糖清除50% DPPH自由基的半数抑制浓度IC50为0.75 mg/mL,VC的IC50为0.38 mg/mL。

图8 云芝多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of Coriolus versicolor polysaccharide on DPPH radical

3 结论

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ResearchonextractionprocessofCoriolusversicolorpolysaccharidesbycompoundenzymatichydrolysisanditsantioxidantactivity

YANGJia-qi,GANGJie*,JIChun-yang,ZHUShu-zhen,WANGShao-jia,MAOYa-ming,LINShan

(College of Life Sciences,Dalian Minzu University,Dalian 116600,China)

Coriolusversicolorpolysaccharide;enzymatic hydrolysis;extraction conditions;response surface method;antioxidant activity

2017-06-20

杨佳琦(1996-),女,本科生,研究方向:食品科学与工程,E-mail:745458518@qq.com。

*通讯作者:冮洁(1965-),女,博士,教授,研究方向:食品生物技术,E-mail:gangjie@dlnu.edu.cn。

大连民族大学大学生创新创业训练计划项目(XA201603105,201712026099);财政专项-中央高校基本科研业务费项目(DC201501020101,DC201501020301)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)23-0176-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.033