几种香辛料精油对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果

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(1.河南农业大学食品科学技术学院,河南郑州 450002;2.河南省产品质量监督检验院,河南郑州 450004)

几种香辛料精油对产气荚膜梭菌的体外抑菌效果

王小慧1,魏法山2,李苗云1,*

(1.河南农业大学食品科学技术学院,河南郑州 450002;2.河南省产品质量监督检验院,河南郑州 450004)

研究白芷精油、黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油对产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens,C.perfringens)的抑制作用,筛选出对产气荚膜梭菌有抑菌效果的香辛料精油。采用牛津杯法和两倍稀释法分别判定不同香辛料精油对C.perfringens(ATCC13124、CICC22949、C1和C2)的抑菌圈大小和最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。结果显示:肉桂精油对C.perfringens的抑菌圈直径最大,且对产气荚膜梭菌 ATCC13124、CICC22949、C1和C2的MIC分别为2.75、2.75、5.5、2.75 mg/mL;艾草精油对C.perfringens的MIC分别为11、2.75、11、2.75 mg/mL;黑胡椒精油对C.perfringens的MIC分别为22、11、11、5.5 mg/mL;茴香精油对C.perfringens的MIC分别为11、5.5、11、2.75 mg/mL;姜精油对C.perfringens的MIC分别为88、22、22、22 mg/mL。结论:除白芷精油以外,其他5种香辛料精油对C.perfringens均有不同程度的抑菌作用,其中肉桂精油对C.perfringens的抑菌效果最佳。

香辛料精油,产气荚膜梭菌,抑菌圈,最小抑菌浓度

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体,可引起多种动物坏死性肠炎、肠毒血症,同时也是人畜创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一[1]。目前,主要使用抗生素及化学合成药物来防治产气荚膜梭菌引起的疾病,这导致产气荚膜梭菌耐药性菌株不断出现,以致疾病难以控制。近年来,植物精油的杀菌功能越来越引起人们的注意,植物精油类物质的杀菌作用较普遍,从中筛选出新型替代物代替抗生素及化学合成药是解决抗生素滥用问题的有效途径[2]。研究发现,肉桂精油、薰衣草精油、草果精油和花椒精油对致病菌都有一定的抑制作用[3-4],肉桂精油的主要化学成分为反式肉桂醛、反式邻甲氧基肉桂醛和乙酸桂酯等[5-7],这些物质具有强烈的抑制或杀死微生物的特性。顾仁勇[8]等人的研究表明,丁香、连翘及肉桂等五种香辛料精油均对细菌、霉菌和酵母具有一定的抑制能力。Deans S G[9]对50种植物精油的抑菌活性进行评价,发现百里香、肉桂、丁香、杏仁、香果和马郁兰6种精油对供试的25种菌种抑制效果最好且最全面。LópezP[10]等用肉桂、丁香、罗勒、迷迭香、莳萝和姜等6种精油分别对革兰氏阳性细菌和阴性细菌和真菌进行了抑菌活性实验,结果表明这6种精油对所选用的革兰氏阳性细菌和阴性细菌及真菌都有一定的抑制效果,其中肉桂和丁香两种精油的抑制效果最好。Tassou[11]等发现NaCl与薄荷精油对沙门氏菌和李斯特菌的抑制具有协同作用。Khalfallah[12]等对阿米芹精油的抑菌活性进行研究,发现其对大肠杆菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯菌有很好的抑制效果。然而,关于精油对产气荚膜梭菌抑菌效果方面,国内外研究较少。

为研究香辛料精油对C.perfringens的抑制效果,本文采用牛津杯法和二倍稀释法研究白芷精油、黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油对C.perfringens的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

产气荚膜梭菌ATCC13124 购于ATCC菌种库;标准菌株CICC22949 购于CICC菌种库;产气荚膜梭菌分离菌株C1和C2真空胀袋熟肉制品中分离得到;白芷精油、黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油(纯度均大于99%,密度均为0.88 g/mL) 购自上海回恩国际贸易有限公司;吐温-80和胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA) 购自北京奥博星生物技术有限责任公司;胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂、液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)和亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂基础培养基(SPS) 购自北京陆桥技术股份有限公司。

HVE-50型蒸汽压力灭菌锅 日本HIRAYAMA公司;VORTEX-2GENIE型涡旋振荡器 美国ScientificIndustries公司;SPX-1505H-Ⅱ型生化培养箱 上海新苗医疗器械公司;SW-CJ-2F型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;C-32型日本三菱瓦斯厌氧培养罐 日本三菱瓦斯化学株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 香辛料精油的配制 将6种香辛料精油分别按照精油4 mL、吐温-80 1 mL、无菌蒸馏水5 mL的比例混合均匀[2],配制成浓度为352 mg/mL的香辛料精油,摇匀,现配现用。

1.2.2 菌悬液的制备 将用磁珠保存的标准菌株和分离菌株均划线到TSC平板培养基上厌氧培养18～24 h,再将TSC上的单个菌落划线到TSA平板培养基上厌氧培养18～24 h,用接种环挑取菌落接种到FTG液体培养基中厌氧培养18～24 h,得到初始菌液(107～108CFU/mL)。

1.2.3 不同香辛料精油对产气荚膜梭菌的抑菌活力研究 牛津杯法[13-16]:吸取200 μL初始菌液至TSA培养基上,用涂布器均匀涂布3次。用无菌镊子取规格完全一致的牛津小杯(10 mm×7.8 mm×6 mm)置于含菌的琼脂平板上,然后用移液枪在牛津杯中加入浓度为352 mg/mL的植物精油悬浮液100 μL,每种植物油做三个平行,另外取三个平板,每个平板放置三个牛津杯涂布菌液,分别吸取100 μL无菌蒸馏水和100 μL吐温-80加入牛津杯中作为空白对照,正置平板于恒温(37 ℃)厌氧培养罐中培养24 h,观察抑菌圈大小并拍照记录结果。

抑菌性判定标准[17-18]:抑菌圈直径大于20 mm为极敏,15～20 mm为高敏,10～15 mm为中敏,7～9 mm为低敏,无抑菌圈者为不敏感。

1.2.4 不同香辛料精油最低抑菌浓度(MIC)的研究 两倍稀释法[19-20]:于13支试管中加入FTG液体培养基各1.0 mL,分别标记为试管1～13,试管1中加入1.2.1步骤中配制好的香辛料精油1.0 mL,混合均匀后,吸取1.0 mL加入试管2中,同法稀释至试管12,从试管12中取出1.0 mL液体至一灭菌空试管中作为空白对照,以便观察香辛料精油是否被污染(标记为试管14)。试管13为阳性生长对照管。香辛料精油的初始浓度为352 mg/mL,那么1～12试管的浓度分别为176、88、44、22、11、5.5、2.75、1.375、0.6875、0.3438、0.1719和0.0859 mg/mL。试管1～13中分别加入100 μL菌液,另取一支试管加入1.0 mL FTG液体培养基,加入1.0 mL和初始香辛料精油浓度相同的吐温-80 1.0 mL和100 μL菌液作为对照实验(助溶剂对照管,标记为试管15),以便观察助溶剂吐温-80对C.perfringens生长有无影响。在37 ℃条件下厌氧培养18～24 h,观察试管内液体是否浑浊,来判断是否有C.perfringens生长。由于某些精油本身具有颜色,试管内液体是否浑浊不易观察清楚,然后分别吸取各试管内液体200 μL至TSA培养基上,涂布均匀,37 ℃厌氧培养24 h,观察结果。凡是无菌生长的TSA平板对应的香辛料精油最高稀释浓度为这种香辛料精油对C.perfringens的最小抑菌浓度。

1.2.5 数据分析 采用Microsoft Excel计算重复实验所测得的抑菌圈直径的平均值及标准差。

2 结果与分析

2.1 不同香辛料精油对产气荚膜梭菌的抑菌活力结果

表1 香辛料精油对产气荚膜梭菌的抑菌活力Table 1 Inhibitory activity of different spices essential oils on Clostridium perfringens

不同香辛料精油对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径大小如表1所示,无论产气荚膜梭菌标准菌株还是分离菌株,6种香辛料精油中,肉桂精油的抑菌圈直径最大,抑菌效果最好,其次分别是艾草精油、茴香精油、黑胡椒精油和姜精油,而白芷精油的抑菌圈直径在9 mm左右,表明白芷精油对产气荚膜梭菌无明显的抑制作用。区敏港[2]等人的研究也表明了黑胡椒精油对产气荚膜梭菌的抑制效果比姜精油的抑制效果好,这与香辛料精油所含的化学成分有关。

2.2 香辛料精油对产气荚膜梭菌的MIC结果

2.2.1 肉桂精油对产气荚膜梭菌的MIC 表2为产气荚膜梭菌在一系列浓度的肉桂精油条件下的生长状况,凡是无菌生长的TSA平板对应的肉桂精油的最高稀释浓度为肉桂精油对C.perfringens的最小抑菌浓度,因此,肉桂精油对产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124、CICC22949、分离菌株C1和C2的最小抑菌浓度分别为2.75、2.75、5.5和2.75 mg/mL,表明肉桂精油对产气荚膜梭菌不同菌株的MIC没有明显差异。

表2 肉桂精油对产气荚膜梭菌生长的影响Table 2 The effect of cinnamon essential oil on the growth of Clostridium perfringens

注:“-”:被抑制,产气荚膜梭菌无大量生长;“+”:产气荚膜梭菌大量生长,表3～表6同。

2.2.2 艾草精油对产气荚膜梭菌的MIC 由表3可知,艾草精油对产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124、CICC22949、分离菌株C1和C2的最小抑菌浓度分别为11、2.75、11和2.75 mg/mL,表明艾草精油对产气荚膜梭菌不同菌株的MIC没有明显差异。

2.2.3 黑胡椒精油对产气荚膜梭菌的MIC 表4为产气荚膜梭菌在一系列浓度的黑胡椒精油条件下的生长状况,黑胡椒精油对产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124、CICC22949、分离菌株C1和C2的最低抑菌浓度分别为22、11、11和5.5 mg/mL。

表3 艾草精油对产气荚膜梭菌生长的影响Table 3 The effect of wormwood essential oil on the growth of Clostridium perfringens

表4 黑胡椒精油对产气荚膜梭菌生长的影响Table 4 The effect of black pepper essential oil on the growth of Clostridium perfringens

2.2.4 茴香精油对产气荚膜梭菌的MIC 由表5可知,茴香精油对产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124、CICC22949、分离菌株C1和C2的最小抑菌浓度分别为11、5.5、11和2.75 mg/mL,表明茴香精油对产气荚膜梭菌不同菌株的MIC存在较大差异。

表5 茴香精油对产气荚膜梭菌生长的影响Table 5 The effect of anise essential oil on the growth of Clostridium perfringens

表6 姜精油对产气荚膜梭菌生长的影响Table 6 The effect of ginger essential oil on the growth of Clostridium perfringens

2.2.5 姜精油对产气荚膜梭菌的MIC 由表6可知,姜精油对产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124、CICC22949、分离菌株C1和C2的最小抑菌浓度分别为88、22、22和22 mg/mL,姜精油对产气荚膜梭菌ATCC13124的MIC明显不同于其他菌株。

3 结论与讨论

产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性致病芽孢杆菌,黑胡椒精油、茴香精油、肉桂精油、姜精油和艾草精油对C.perfringens均有不同程度的抑制作用,其中肉桂精油对C.perfringens的抑制效果最佳,其次为艾草精油、茴香精油、黑胡椒精油和姜精油,而白芷精油对C.perfringens无明显的抑制作用。不同香辛料精油对产气荚膜梭菌的MIC不同,这与香辛料精油所含的化学成分有关[3],区敏港[2]等人的研究结果发现,黑胡椒精油对产气荚膜梭菌的抑菌效果比姜精油的抑菌效果好。此外,也有研究表明,肉桂精油对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌也具有抑制作用[21-22],茴香精油对细菌也均有一定的抑制作用[23]。然而,由于香辛料精油对产气荚膜梭菌抑菌效果的研究较少,还需进一步研究其他香辛料精油对产气荚膜梭菌的抑菌效果及作用机理。

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BacteriostaticeffectsofdifferentspicesessentialoilsonClostridiumperfringensinvitro

WANGXiao-hui1,WEIFa-shan2,LIMiao-yun1,*

(1.College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;2.Product Quality Supervision and Inspection Institute of Henan Province,Zhengzhou 450004,China)

The effect of different spices essential oils(angelica essential oil,black-pepper essential oil,anise essential oil,cinnamon essential oil,ginger essential oil and wormwood essential oil)on the growth ofClostridiumperfringen(C.perfringens)was studied to select the spices essential oils which had inhibitory effect onClostridiumperfringens. Oxford cup method and two times dilution method were selected to determine the antibacterial circle and minimum inhibitory concentration(MIC)forC.perfringens(Standard strain ATCC13124 and CICC22949,isolated strain C1and C2). The result showed that the diameter of antibacterial circle of cinnamon essential oil was the largest,and the minimum inhibitory concentration(MIC)of cinnamon essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 2.75,2.75,5.5 and 2.75 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of wormwood essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 11,2.75,11 and 2.75 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of black-pepper essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 22,11,11 and 5.5 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of anise essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 11,5.5,11 and 2.75 mg/mL,respectively. The minimum inhibitory concentration of ginger essential oil onC.perfringensATCC13124,CICC22949,C1and C2were 88,22,22 and 22 mg/mL,respectively. Conclusion:In addition to angelica essential oil,other five spices essential oils had inhibitory effect onC.perfringens,and the inhibition effect of cinnamon essential oil onC.perfringenswas the best.

spices essential oils;Clostridiumperfringens;antibacterial circle;minimum inhibitory concentration(MIC)

2017-03-06

王小慧(1994-)，女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工与质量控制，E-mail:15136277292@163.com。

*通讯作者:李苗云(1976-)，女，博士，教授，研究方向：肉品加工与安全控制，E-mail:limy7476@126.com。

国家自然科学基金项目(31571856)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)23-0010-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.003