黑龙江省汉族人群血小板抗原1~17 系统基因多态性研究*

颜廷宇 李鑫 丁镌 毕冬梅 王鑫 刘颖

黑龙江省汉族人群血小板抗原1~17 系统基因多态性研究*

颜廷宇 李鑫 丁镌 毕冬梅 王鑫 刘颖

目的 探讨黑龙江省汉族人群人类血小板同种抗原（Human platelet alloantigen，HPA）1～17系统基因多态性及其表达频率，确定有临床意义的血小板抗原系统。方法 选择123例汉族的健康无血缘关系的人群为研究对象，采用聚合酶链-序列特异性引物（PCR-SSP）技术，对HPA1-17系统等位基因进行分型，分别计算其基因频率、基因型频率，并与国内外不同人群进行比较。结果 黑龙江省汉族人群HPA-1a、2a、3a、5a、6a、15a 基因频率分别是0.987 8、0.959 4、0.682 8、0.971 5、0.983 7、0.479 6，HPA-4a、7a～14 a、16 a和17a均为1.0；HPA-1b 、2b 、3b、5b、6b 、15b 基因频率分别是0.012 2、0.040 7、0.317 1、0.028 5、0.016 3、0.520 4，未检测出HPA-4b、7b～14b、16b和17b。统计汉族人群HPA基因组合型及其频率，发现共有24种HPA基因组合型，前3种基因组合型频率均＞10%（占55.28%），其余21种基因组合型的频率均＜7.5%（44.72%）。结论 黑龙江省汉族健康人群HPA1～17基因频率的分布与其他地区和国家相比具有本地区人群特点。HPA-3、15系统具有高度多态性，在随机血小板输注中，供受者HPA-3、15 系统不配合率分别为33.93%、37.46%，易发生同种免疫反应。

人类血小板同种抗原 基因型 多态性

人类血小板同种抗原（Human platelet alloantigen，HPA）是血小板特异性抗原，为常染色体双等位基因共显性遗传，其等位基因位于第5、6、17、22号染色体上[1]。HPA系统存在遗传多态性并表现出种族和地域差异，而通过HPA基因多态性及基因频率的种族和地域间差异研究，对血小板输注无效、新生儿同种免疫血小板减少性紫癜、输血后血小板减少性紫癜等HPA免疫性疾病的预防和治疗具有重要意义。本文采用PCRSSP技术，选择黑龙江省汉族人群为研究对象，研究血小板抗原1～17系统基因多态性特点，并分析其等位基因频率。

材料与方法

1 材料 随机抽取黑龙江省汉族无血缘关系、健康献血者标本123例，年龄18～55岁。采集外周静脉血样（EDTA抗凝）5 ml。

2 试剂和仪器 TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂（批号k9627，美国 Tiangen公司），HPA（1～17 ）基因检测试剂盒（批号1202，天津秀鹏生物技术开发有限公司），核酸蛋白测定仪（Genequant ），PE9700 PCR 扩增仪，BIO-RAD PCR 扩增仪，RUNONE 型电泳仪，凝胶成像系统（美国伯乐XRT）。

3 DNA提取 应用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明书提取基因组DNA，核酸蛋白测定仪检测，DNA浓度为40～100 ng/µl，DNA纯度A260/A280比值为1.6～1.8。

4 HPA基因分型检测 应用HPA1～17基因检测试剂盒，采用PCR-SSP方法对HPA1～17共17个抗原系统34个等位基因进行基因分型，操作步骤严格按试剂说明书进行。PCR扩增条件为：96℃ 2 min； 96℃ 20 s，65℃ 50 s ，70℃ 60 s ，5个循环；96℃ 20 s，65℃ 50 s ，72℃ 45 s ，10个循环； 96℃ 20 s，62℃ 50 s ，72℃ 45 s ，22个循环；72℃ 延伸5 min，降温至4℃保存。PCR反应产物7 µl转移至 2.5%琼脂糖凝胶孔，于140 V电压下电泳15 min，以内参质控带和特异扩增产物阳性分型带清晰分开为准，凝胶成像仪内观察结果，拍摄成像。对照反应格局图，进行HPA1～17基因型判定。

5 统计学处理 采用直接计数法计算基因组合型频率；应用SPSS20.0软件计算卡方值，比较基因型分布期望值与观察值之间的吻合度，验证是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡检验（H-W检验）；不同人群间HPA1-17基因频率多态性分布的比较采用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义；各系统对偶抗原不配合率计算MP=2ab（1-ab）（a、b分别代表对偶抗原等位基因频率）。

结 果

1 HPA基因型频率及等位基因频率 123例黑龙江省汉族人群献血者获得HPA1～17基因PCR-SSP扩增产物凝胶成像图，其中1个样本HPA基因分型检测结果见图1。据统计分析，HPA-1a、2a、3a、5a、6a、15a 基因频率分别是0.987 8、0.959 4、0.682 8、0.971 5、0.983 7、0.479 6，HPA-4a、7a～14 a、16 a和17a均为1.0；HPA-1b、2b、3b、5b、6b 、15b 基因频率分别是0.012 2、0.040 7、0.317 1、0.028 5、0.016 3、0.520 4，未检测出HPA-4b、7b-14b、16b和17b （表1）。2 黑龙江省汉族与国内外不同民族人群的HPA等位基因频率的比较 黑龙江省汉族人群与本地区朝鲜族人群比较，HPA-2、HPA-3、HPA-15的基因频率的差异有统计学意义（P＜0.05）；与本地区蒙古族比较，HPA-3、HPA-5的基因频率的差异有统计学意义；与本地区满族人群比较，HPA-3基因频率差异有统计学意义；与武汉人群比较，HPA-3、HPA-5的基因频率差异有统计学意义；与云南汉族人群比较，HPA-3、HPA-15的基因频率差异有统计学意义；与广州人群比较，HPA-2、HPA-3、HPA-15的基因频率差异有统计学意义；与长春人群比较，HPA-2、HPA-3的基因频率差异有统计学意义；与青岛人群比较，HPA-3基因频率差异有统计学意义（表2）；与英国人群比较，HPA-1、HPA-5、 HPA-6的基因频率差异有统计学意义；与美国人群比较，HPA-1、HPA-2、HPA-5的基因频率差异有统计学意义（表3）。与日本人群比较，HPA-2、HPA-3基因频率差异有统计学意义（表3）。

表1 黑龙江省汉族HPA-1～17基因型和等位基因频率（n=123）

表2 黑龙江省汉族与国内不同民族人群HPA-1～6、15系统等位基因频率比较

续表2

表3 黑龙江省汉族与国外人群HPA-1～6系统等位基因频率比较

讨 论

本文通过PCR-序列特异性引物技术检测黑龙江省123名汉族随机健康献血者的HPA基因，通过统计学方法分析HPA1～17的基因型分布和等位基因频率（表1）。HPA等位基因座Hardy-Weinberg平衡吻合度的检验结果均为P＞0.05，表明本研究人群的基因分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。本研究分析发现黑龙江省汉族HPA 基因有24 种组合型，其中3 种基因组合型频率＞10%（55.28%），分别是HPA-1a，2a，3a，4a，5a，6a，7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，15ab，16a，17a（23.57%）；HPA-1a，2a，3ab，4a，5a，6a，7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，15ab，16a，17a（21.14%）；HPA-1a，2a，3a，4a，5a，6a，7a，8a，9a，10a，11a，12a，13a，14a，15b，16a，17a（10.57%）；另外21种基因组合型的频率均＜10%（44.72%），说明黑龙江地区的HPA基因遗传背景较接近。HPA1～17 基因型频率中HPA3、HPA15具有高杂合度，其余主要以aa 纯合子为多，ab杂合子少，没有bb 纯合子出现。HPA1～17基因系统中的HPA 1～17a全部表达并呈高频分布；HPA-b基因中的HPA1b、2b、3b、5b、6b 和15b有表达，其中3b、15b呈高频分布，而HPA4b、HPA7b～14b、HPA16b 和HPA17b未表达。HPA各系统对偶抗原不配合率越高，提示诱发同种抗体的潜在可能性也越高。本次调查发现黑龙江汉族HPA-3、HPA-15系统不配合率分别为33.93%、37.46% ，远远高于HPA其他系统不配合率，表明HPA-3、HPA-15系统发生免疫反应产生相应免疫抗体的可能性很高，是导致本地区血小板输注无效的最主要HPA系统，这与南昌、吉林等地区的研究结果一致[10-12]。

本文通过与国内外不同地区HPA-1～6，15系统基因频率（表2、表3）的比较分析发现，黑龙江省汉族人群与其他民族、地域HPA基因频率比较，差异均有统计学意义，说明黑龙江省汉族HPA基因频率具有遗传多态性，其遗传多态性具有种族、地域差异。黑龙江省汉族人群中HPA基因频率不论与黑龙江本地区蒙古族、满族、朝鲜族人群比较（表2），还是与武汉、云南汉族、广州、长春、青岛等地区人群比较，或者与日本比较（表3），HPA-3系统基因频率的差异均有统计学意义（P＜0.05）；而与欧、美人群在HPA-3系统基因频率比较差异没有统计学意义，在HPA-1、HPA-5系统基因频率差异有统计学意义（表3）。据文献报道，HPA-1、 HPA-5是引起白种人免疫性血小板减少的主要血型系统，占免疫性血小板同种抗体发生率的79%[13]。但HPA -1b基因频率在亚洲人群中是很低的，这也是亚洲人群输血后血小板减少性紫癜（NAITP）和输血后血小板减少性紫癜（PTP）发生较少的主要原因。不同地区发生HPA免疫性疾病的HPA基因不同，证明了HPA 基因的种族多态性、地域间差异。建立本地HPA已知型的血小板基因库，可以避免产生HPA 同种免疫抗体，预防PTP 、NAITP 等HPA同种免疫性疾病，为人类遗传学研究提供了有价值的数据。

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Genetic Polymorphism of HPA1-17 Alloantigen System in Heilongjiang Han Population

YAN Ting-Yu，Li Xin，Ding Juan，et al. Harbin Blood Center，Harbin150056

Objective To analyze the allele frequencies and the polymorphisms of Human platlet antigen 1 to 17 system in Heilongjiang Han population for determination of their clinical significance. Method PCR-SSP was used for HPA1-17 genotyping among 123 unrelated Han nationality volunteer donors. The genotypes and gene frequencies of the each HPA gene system were calculated，and the difference with other populations were compared. Result The gene frequencies of HPA-1a，2a，3a，5a，6a，15a were 0.9878，0.9594 ，0.6828，0.9715，0.9837，and 0.4796，respectively，and the gene frequencies for all of HPA-4a，7a～14a，16a，17a were found to be 1.0. The gene frequencies of HPA-1b，2b，3b，5b，6b，15b were 0.0122，0.0407，0.3171，0.0285，0.0163，and 0.5204，respectively. HPA-4b and 7b to 14b and 16b to 17b were undetactabl. The study is the first time to investigate the assortment of HPA genes and their frequencies. The 24 assortment systems were found in Heilongjiang Han population，and only 3 of HPA gene frequencies more than 10%，and 21 less than 7.5% were noted. Conclusion Distribution of the allele polymorphisms of HPA 1-17 in Heilongjiang Han population was featured compared with other regions and countries. The system of HPA-3，15 in Han population with highpolymorphism in that the incompatibility rates of donor recipient HPA-3，15 were 33.93% and 37.46% in random platelets infusion.

Human platelet antigens Genotype Polymorphism

R457.1 Q343.1

A

1671-2587（2017）06-0623-05

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.028

*本课题受2012年度黑龙江省卫生厅科技计划课题（No.2012-081）资助

150056 黑龙江省哈尔滨市血液中心输血研究所

颜廷宇（1983–），女，黑龙江拜泉人，主管技师，学士，主要从事输血医学、免疫遗传学研究工作，（Tel）0451-82437137。

刘颖，女，主任技师，主要从事输血医学、免疫遗传学研究工作，（E-mail）liuying54609@126.com。

2017-08-01）

（本文编辑：王敏）