安徽地区汉族孕妇人群MTHFR基因多态性研究*

汪波 范利平 史德宝 程筱雯 李洁 徐元宏

安徽地区汉族孕妇人群MTHFR基因多态性研究*

汪波 范利平 史德宝 程筱雯 李洁 徐元宏

目的 探讨安徽地区孕妇编码叶酸代谢通路中关键酶的基因亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T位点的基因型及等位基因的频率分布,以指导孕妇孕期合理补充叶酸。方法 采用PCR-芯片杂交法，对2016 ～2017年采集的484例安徽地区孕妇外周血样本进行基因型测定,并与其他地区人群的数据进行比较。结果 安徽地区汉族孕妇 MTHFR C677T 的3种基因型 CC、TC 和 TT 频率分别为 25.2 % 、49.2 % 和 25.6 % ，与山东、四川、云南、广东以及海南地区女性人群等位基因频率的差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 MTHFR 基因 C677T 多态性分布具有地区差异，安徽地区50%以上的育龄女性携带高风险基因，基于C677T多态性检测的孕期叶酸个体化用药指导将是进一步降低出生缺陷的重要方法。

安徽地区 汉族女性人群 MTHFR 基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是一种催化5，10-亚甲基四氢叶酸向5-甲基四氢叶酸不可逆转换的关键酶，与体内叶酸/同型半胱氨酸（HCY）的代谢、蛋氨酸的合成以及DNA和RNA合成有关[1]。因此，MTHFR基因的缺陷导致机体多个基础生化过程的紊乱，并进而引起神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症[2-4]。

迄今为止，MTHFR基因多态性已被发现，其中，C677T 和 A1298C 最常见，导致其酶活性下降，血浆叶酸浓度下降以及同型半胱氨酸在体内蓄积[5]。多项研究证实C677T基因多态性在孕早期干扰神经管闭合，导致神经管畸形、唇腭裂等多种疾病甚至流产[6-8]。本研究开展安徽地区484名孕妇外周血的MTHFR基因多态性研究，并与其他论文中已发表的9个省份中的女性人群比较[9]，进而了解C677T基因多态性的分布情况及分子遗传学特征，以期为安徽地区孕妇个体化补充叶酸提供证据。

对象与方法

1 研究对象 收集2016年9月～2017年8月在安徽医科大学第一附属医院正常产检的安徽汉族孕妇外周血样本，共484例（孕妇人群地理分布见图1），年龄18～38岁（27.7±3.46）。

2 试剂与仪器

2.1 试剂：全血基因组提取试剂盒（上海百傲科技有限公司，批号20160919）；MTHFR（C677T）基因检测试剂盒（PCR-芯片杂交法，上海百傲科技有限公司，批号20160927）；免疫显色试剂（上海百傲科技有限公司，批号20160926）。

2.2 仪器：低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；高速离心机（德国eppendorf公司）；罗氏荧光定量扩增仪COBAS Z480（德国罗氏公司）；BR-526-24全自动杂交仪（上海百傲科技有限公司）；BaiO®BE-2.0生物芯片识读仪（上海百傲科技有限公司）。

3 实验方法

3.1 样本DNA制备：采用细胞裂解法从外周血细胞中将基因组DNA提取纯化出来，具体操作按照产品说明书严格执行，DNA浓度应在10～60 ng/µl，A260/A280比值在1.5～2.0,样本DNA在2℃～8℃可以贮存1周或-20℃贮存1个月，反复冻存不超过3次。

3.2 PCR扩增：将2 µl样本DNA与1 µl反应液A以及22 µl MTR扩增液加入PCR扩增管混匀；将扩增管放入PCR仪器中，按照下列条件扩增：50℃ 5 min；94℃ 5 min；94℃ 25 s，56℃ 25 s，72℃25 s，35个循环 ；72℃ 5 min。取出扩增产物，2℃～8℃保存，具体操作按照产品说明书严格执行。

3.3 杂交显色：将显色液、杂交反应液、抗体液按照要求加入相应管内，插入试剂架相应位置中，运行杂交程序：42℃ 5 min（预杂交液）；42℃ 30 min（杂交反应液）；42℃ 6 min X 2（洗液1）；28℃ 5 min X 2（洗液2）；28℃ 20 min（抗体液）；28℃ 5 min X 2（洗液2）；28℃3 min（洗液3）；42℃ 30 min（显色液）；28℃2 min X 2（预杂交液）。反应结束后，取出芯片放入生物芯片识读仪中，用Baio基因芯片图像分析软件（Baio Array Doctor）V2.0进行图像扫描与数据分析，输出检测结果。具体操作按照产品说明书严格执行。

4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件包，根据Hardy-Weiberg平衡定律计算各基因型个体数的期望值，组间基因型频率及等位基因频率的差异比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

图1 安徽地区484例孕妇人群地理分布图

1 安徽地区汉族女性人群MTHFR基因C677T基因型多态性 本研究共收集安徽地区孕妇外周血样本484例（见图1），年龄18～38岁（27.7±3.46）。将样本MTHFR C677T位点检测数据进行Hardy-Weiberg遗传平衡检验，均符合Hardy-Weiberg定律，证明样本具有该区域群体代表性。检测结果显示677CC、677CT和677TT基因型分别为122（25.2%）、238（49.2%）和124（25.6%）例，进一步计算得出677C和677T等位基因在该人群中的分布频率分别为49.8%和50.2%。数据见表1。

2 安徽地区与其他地区汉族女性人群基因多态性分布频率对比分析 安徽地区与江苏、湖北、四川等9省汉族女性人群MTHFR基因C677T位点多态性比较见表1。结果显示，安徽地区女性人群677T等位基因频率为50.2%,与江苏（43.5%）、湖北（40.3%）、河南（60.2%）、陕西地区（54.3%）女性人群等位基因频率的差异无统计学意义，而与山东（63.1%）、四川（36.0%）、云南（36.3%）、广东（28.5%）以及海南地区（24.0%）女性人群等位基因频率的差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，本研究及比较结果进一步证实MTHFR基因C677T等位基因频率具有显著的地区渐变趋势，即由南向北等位基因的频率越来越高（最南方的海南省为24.0%，中部的安徽省为50.2%，而最北边的山东省为63.1%）。

表1 安徽地区汉族孕妇人群与其他9省汉族女性人群MTHFR C677T基因型及其等位基因频率比较[9]

讨 论

叶酸是细胞分裂与修复的关键因子，且在调节表观基因的表达方面发挥重要作用。孕妇在孕期需要更多的叶酸以满足胎儿生长的需要。研究表明，流产、神经管畸形、唇腭裂等多种疾病的发生与叶酸的浓度密切相关[6,7,10]。我国从2006年起，规定怀孕前3个月开始补充叶酸，由国家免费提供，剂量为每天400微克，用以预防神经管畸形、唇腭裂等多种出生疾病。然而研究发现，MTHFR基因中C677T在人群中的多态性使酶活性严重下降。因此，每个个体对叶酸的代谢能力不同，使得叶酸的补充宜遵循个体化用药原则。

本研究对安徽地区484名汉族孕妇体内MTHFR基因进行分型，结果显示该人群中MTHFR基因C677T位点存在基因多态性现象。通过与其他9省比较结果发现，该位点等位基因频率存在地区差异性，即C677T等位基因从南到北有逐渐上升的趋势。安徽地区与山东、四川、云南、广东以及海南地区女性人群等位基因频率具有显著差异，提示该位点在安徽与这些地区有着不同的遗传背景。此外，安徽地区677T基因频率为50.2%,提示将近50%孕妇携带风险突变基因，对这些孕妇的个体化用药指导是进一步降低出生缺陷的重要方法。

中国地域广阔、民族众多，多项研究表明女性人群中MTHFR基因C677T多态性的分布存在一定的群体和地域差异。因此，基于MTHFR基因C677T多态性检测的孕期叶酸个体化用药指导将是进一步降低出生缺陷的重要手段。

1 Yang B, Liu Y, Li Y,et al. Geographical distribution of MTHFR C677T, A1298C and MTRR A66G gene polymorphisms in China：findings from 15357 adults of Han nationality[J]. PLoS One, 2013, 8（3）：e57917.

2 Yang B, Fan S, Zhi X,et al. Geographical and ethnic distribution of MTHFR gene polymorphisms and their associations with diseases among Chinese population[J]. Clin Genet, 2016，92（3）：243-258.

3 Kim KR, Yoon JH, Shim HJ,et al. Role of depth of response and MTHFR genotype as predictors of fluorouracil rechallenge therapy for refractory metastatic colorectal cancer[J]. Oncol Lett, 2017, 14（2）：2491-2498.

4 Zhao M, Wang X, He M,et al. Homocysteine and Stroke Risk：Modifying Effect of Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T Polymorphism and Folic Acid Intervention[J]. Stroke, 2017, 48（5）：1183-1190.

5 Xiao WL,Wu M,Shi B.Folic acid rivals methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR）gene-silencing effect on MEPM cell proliferation and apoptosis[J]. Mol Cell Biochem, 2006, 292（1-2）：145-154.

6 Yan L, Zhao L, Long Y,et al. Association of the maternal MTHFR C677T polymorphism with susceptibility to neural tube defects in offsprings：evidence from 25 case-control studies[J]. PLoS One,2012, 7（10）：e41689.

7 Morales de Machin A, Mendez K, Solis E,et al.C677T polymorphism of the methylentetrahydrofolate reductase gene in mothers of children affected with neural tube defects [J]. Invest Clin, 2015, 56（3）：284-295.

8 Merviel P, Cabry R, Lourdel E,et al. Comparison of two preventive treatments for patients with recurrent miscarriages carrying a C677T methylenetetrahydrofolate reductase mutation：5-year experience[J]. J Int Med Res, 2017,（DOI:10.1177/0300060516675111）.

9 Fan S, Yang B, Zhi X,et al. Combined genotype and haplotype distributions of MTHFR C677T and A1298C polymorphisms：A cross-sectional descriptive study of 13,473 Chinese adult women[J]. Medicine（Baltimore）, 2016, 95（48）：e5355.

10 Millacura N, Pardo R, Cifuentes L,et al. Effects of folic acid fortification on orofacial clefts prevalence：a meta-analysis[J]. Public Health Nutr, 2017, 20（12）：2260-2268.

Polymorphism of MTHFR Among Pregnant Woman in Anhui Province

WANG Bo, FAN Li-ping, SHI De-bao, et al.Department of clinic laboratory, the First affiliated hospital of Anhui Medical University, Hefei230022

Objective To investigate the genotype distribution of the methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T essential for the folic acid biosynthetic pathway among Chinese Han pregnant women in Anhui province, so as to provide pregnant women with guidance of supplementing folic acid. Methods By mean of PCR- chip hybridization method, 484 samples collected from Anhui province were detected the genotype distributions and allele frequencies of MTHFR C677T, then, the results were compared with published data in other 9 provinces of China. ResultsIn Anhui Han pregnant women population，the CC，TC，and TT genotypic frequencies of SNP C677T were 25.2 % ,49.2% and 25.6 %，respectively．Significant different of genotypic frequencies have been observed between Anhui women population and Shandong, Sichuan, Yunnan and Hainan women population （P＜0.05）. Conclusion The distributions of C677T in the MTHFR gene showed geographical variations. The polymorphisms of MTHFR may play a role in birth defects risk, thus, periconceptional folic acid supplementation and healthcare following gene polymorphism investigation may be a powerful measure to decrease congenital malformations.

Anhui province Pregnant woman population MTHFR Gene polymorphism

R392.11

A

1671-2587（2017）06-0581-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.015

*本课题受国家自然基金（No. 81601446）、安徽省自然科学基金（No.1708085QH210）、安徽医科大学第一附属医院科研基金（No.3101005001238）资助

230022 合肥，安徽医科大学第一附属医院检验科

汪波（1988–），男，安徽合肥人，检验技师，博士，主要从事病原微生物学检测，（E-mail）wangbo8711@126.com。

徐元宏，男，教授，主任技师，硕士生导师，（E-mail）xyhong1964@163.com。

2017-04-10）

（本文编辑：潘健）