引起虹鳟鱼苗大量死亡病因分析

文/王静波 贾丽 徐立蒲 王小亮 张文 王姝 曹欢

引起虹鳟鱼苗大量死亡病因分析

文/王静波 贾丽 徐立蒲 王小亮 张文 王姝 曹欢

北京市鲟鱼、鲑鳟鱼创新团队专栏

2017年3月～4月，北京怀柔一家虹鳟鱼养殖场虹鳟鱼苗发病，且出现大量死亡。患病鱼主要表现为无活力，漂浮水面，集中于池子四角；鳃盖张开，严重患病鱼鳍条和尾柄出现溃烂。为确定病因，将患病鱼分别进行传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、细菌以及寄生虫检测。检测结果显示：IHNV阴性；未分离到细菌；在患病鱼鳃和体表均发现大量三代虫，且体表数量最多，经PCR检测和序列比对确定为细鳞鲑三代虫。故判断导致该场虹鳟鱼苗大量死亡的病因是感染了细鳞鲑三代虫。

鲑鳟鱼是优质的冷水鱼类，随着养殖规模的不断扩大，国际贸易频繁，病害也凸显，如传染性造血器官坏死病（IHN），已给全国乃至世界虹鳟鱼养殖业造成严重影响，成为目前制约鲑鳟鱼产业发展的主要瓶颈。另外，因感染三代虫造成鲑鳟鱼苗大量死亡也有报道，如大西洋鲑三代虫病是必须向OIE申报的疾病，该病仅两年就使挪威野生大西洋鲑科鱼幼鱼数量下降50%。2017年3月～4月，北京市怀柔区一家虹鳟鱼养殖场虹鳟鱼苗出现大量死亡，且持续时间较长，累计死亡率达80%以上，死亡30余万尾。针对这一情况，本文作者对患病鱼分别进行了IHNV、细菌和寄生虫检测。经检测，IHNV阴性，未分离到细菌，却在患病鱼鳃和体表均发现大量细鳞鲑三代虫。现将结果报告如下。

一、材料方法

1.材料

患病虹鳟鱼来自北京怀柔一家虹鳟鱼养殖场。鱼体规格4cm～5cm。

2.主要试剂

脑心浸液琼脂培养基购于北京陆桥生物技术有限公司。哥伦比亚血琼脂培养基购于北京威泰科生物技术有限公司。DNA抽提试剂盒及PCR相关试剂购于上海生物工程有限公司。

3.病原菌分离

取具典型症状的患病虹鳟鱼苗，无菌操作从肝、脾和肾划线分离于脑心浸液琼脂（BHIA）平板和哥伦比亚血琼脂培养基，于22℃恒温培养箱培养48h。

4.IHNV检测

依据GB/T 15805.2-2008的要求，进行细胞分离和PCR检测。

5.寄生虫检测

显微镜检：取鳃组织制作水浸片，同时刮体表粘液压片，进行观察。

分子技术：依据OIE水生动物诊断试验手册提供方法。在解剖镜下，挑去单个虫体，放入无水酒精中固定，备用DNA抽提。PCR扩增内转录间隔区（ITS）序列。引物5′-TTTCCGTAGGTGAACCT-3′和5′-TCCTCCGCTTAGTGATA-3′扩增1300bp的ITS区域。PCR反应体系50ul，PCR反应条件95 ℃ 预变性5分钟； 94 ℃变性1分钟、50℃退火1分钟、72℃ 延伸2分钟，循环30次；最后72℃延伸7分钟。PCR产物由上海生物工程有限公司进行测序。

二、结果

1.发病情况

发病渔场虹鳟鱼苗2017年3月初出现死亡，且持续死亡，累计死亡率达80%以上，死亡30余万尾。患病鱼主要表现为无活力，漂浮水面，集中于池子四角；鳃盖张开；严重患病鱼鳍条和尾柄出现溃烂。在此期间，养殖水温11℃～12℃。

2.IHNV检测和细菌分离

IHNV检测结果为阴性；未从患病鱼内脏中分离到细菌。

3.寄生虫检测

（1）形态观察：在鳃组织水浸片和体表粘液压片中均发现大量活虫体，形态类似三代虫（见图1）。在体表粘液中的虫体很快降解，很多虫体仅剩下一对大钩（见图2）。在解剖镜下，可见在患病鱼体表和鳍条遍布密密麻麻的活体三代虫，虫体不断伸缩（由于解剖镜无拍照功能，本文中未提供照片）。

图1 体表粘液虫体

图2 虫体固着器-大钩

（2）三代虫ITS基因序列分析：样品经PCR扩增出三代虫属基因片段约1300bp。序列经测序后，在NCBI上经Blast同源性检索，发现其与GeneBank登记的编码为KP325622细鳞鲑三代虫的同源性最高，基因序列一致性99.43%。（见图3）

三、讨论

通过对具有典型临床症状的患病虹鳟鱼苗寄生虫检测，在其鳃和体表发现大量活体三代虫，尤其是体表，虫体密密麻麻遍布全身。寄生虫病的确诊主要是依据感染强度来判断，当大量的三代虫寄生鱼苗体时，即可诊断为该鱼苗已患三代虫病。为进一步确定三代虫种类，对虫体核酸进行PCR检测与基因比对序列分析，结果显示与GeneBank登记的编码为KP325622（细鳞鲑三代虫）的基因序列一致性达99.43%，故判断该场虹鳟鱼苗感染的三代虫为细鳞鲑三代虫。根据检测结果和结合临床症状综合分析，引起渔场虹鳟鱼苗大量死亡原因为感染了细鳞鲑三代虫。

根据中华人民共和国农业部发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中规定，将三代虫病列为三类疫病。三代虫主要寄生在鱼体表和鳃，广泛分布于世界各地海水和淡水水域，能寄生于绝大多数野生及养殖鱼类，已报道的有400余种。三代虫隶属于单殖吸虫，胎生，繁殖和传播迅速，容易大面积爆发，尤其对鱼苗影响较大，易造成鱼苗大批量死亡。据报道大西洋鲑三代虫仅两年就使挪威野生大西洋鲑科鱼幼鱼数量下降了50%，对养殖业有较大的危害。上世纪九十年代末，我国黑龙江宁安渤海冷水鱼试验站养殖的细鳞鲑爆发细鳞鲑三代虫病，12天死亡率达47%；2005年在陕西一家虹鳟鱼养殖也暴发过细鳞鲑三代虫病。

防治三代虫有效的方法是使用菊酯类的药物，如敌百虫等。但是由于虹鳟鱼对敌百虫非常敏感，不适合用它进行治疗。OIE水生动物诊断试验手册介绍了用高盐度水，福尔马林及含有氯和碘的化合物治疗大西洋鲑三代虫病的方法，结合本地情况作者建议该场使用高盐度水进行治疗，病情迅速得到控制。根据养殖者对发病史的叙述，作者分析本场发病原因可能与放养密度大，投饲量高，导致环境变差，而引发该病的暴发，因此还需要合理放养和投食。

近些年，国内外报道虹鳟鱼苗因感染IHNV等病毒造成大量死亡病例较多，而因感染寄生虫造成大量死亡的病例较少。因此，在今后虹鳟鱼苗病害诊断与防控中也要注意寄生虫病等。

图3 ITS部分核酸序列比对结果（仅为部分截图）

作者单位：北京市水产技术推广站