冠心病患者Hcy和SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化相关性研究〔1〕

李莉，高胜利，2*，翟晓娟，郭任维，李树峰

(1.山西医科大学附属汾阳医院，山西 汾阳 032200；2.山西医科大学汾阳学院，山西 汾阳 032200；3.中国医学 科学院医学信息研究所，北京 100020)

冠心病患者Hcy和SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化相关性研究〔1〕

李莉1，高胜利1，2*，翟晓娟1，郭任维1，李树峰3

(1.山西医科大学附属汾阳医院，山西 汾阳 032200；2.山西医科大学汾阳学院，山西 汾阳 032200；3.中国医学 科学院医学信息研究所，北京 100020)

目的：探讨冠心病患者血浆同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)与外周血淋巴细胞基因组甲基化水平的相关性。方法：选取山西省汾阳医院心血管内科冠心病患者70 例(观察组)，另选取70 例健康人群为对照组，用酶联免疫吸附法检测血浆Hcy、SAH和DNA甲基转移酶(DNMTs)水平。提取全血淋巴细胞DNA，用酶联免疫吸附法检测淋巴细胞基因组甲基化水平。结果：与对照组比较，观察组血浆Hcy含量、SAH含量显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，观察组血浆DNMTs含量、全基因组甲基化水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组外周血淋巴细胞基因组甲基化与Hcy (r=-0.757，P<0.05)、SAH(r=-0.94，P<0.01)呈负相关，SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化相关性高于Hcy(Z=4.756，P<0.01)。DNMTs与Hcy(r=-0.537，P<0.05)、SAH(r=-0.672，P<0.01)呈负相关，SAH与DNMTs相关性高于Hcy(Z=7.745，P<0.01)。结论：冠心病患者外周血淋巴细胞基因组甲基化水平显著降低，与Hcy和SAH呈负相关，且与SAH的相关性高于Hcy。

同型半胱氨酸；S-腺苷同型半胱氨酸；基因组甲基化

同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)都是蛋氨酸的代谢产物[1]，Hcy增高被认为是冠心病(CAD)的高危因素之一[2]。然而大规模的使用维生素B和叶酸降低了血浆Hcy水平，却未能改善血管损伤和减少动脉粥样硬化的风险[3-4]。有学者提出Hcy并不是冠心病的直接致病原因，而是另外一个危险因素SAH的标志物，即Hcy的毒性来自于SAH的累积，但需要更多的证据来证实[5]。DNA甲基化是表观遗传的重要分子机制，基因组DNA甲基化水平改变是评价心血管疾病的指标之一。研究显示，外周血白细胞基因组甲基化水平下降与Hcy和SAH均呈负相关[6-8]。然而有关中国人群冠心病患者中Hcy和SAH与外周血白细胞基因组甲基化水平相关性的报道甚少，对此本文进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年6月—2016年6月山西省汾阳医院心血管内科冠心病患者70 例(观察组)。冠心病诊断参照中国冠心病诊疗指南[9-11]，冠状动脉造影证实其冠状动脉至少有一支狭窄度≥50%；排除糖尿病、感染性疾病、恶性肿瘤或严重肝肾功能不全者。对照组选择某单位体检排除冠心病的健康人群70 例。所有入选者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器及试剂

多功能酶标仪(美国伯腾)，UV755B分光光度计(苏州莱顿)，Hcy和SAH酶联免疫吸附法试剂盒(美国Arthus Biosystems)，人外周血淋巴细胞分离液(北京索莱宝)，DNA提取试剂盒(大连博士德)，甲基转移酶(DNMTs)酶联免疫吸附法试剂盒和基因组DNA甲基化定量检测试剂盒(美国Epigentek)。

1.3 临床指标检测

测量两组人群身高体重，计算身体质量指数。连续3天同一时间测量血压水平。Olympus2700生化分析仪测定血脂水平，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(APOA1)、载脂蛋白B(APOB)。

1.4 血浆Hcy、SAH和DNA甲基转移酶含量检测

空腹静脉采血5 mL放入EDTA抗凝管中，2 000～3 000r/min离心20min，分离出血浆，分装并-20℃保存，采用酶联免疫法测定以上指标[12-13]。

1.5 全基因组甲基化分析

空腹静脉采血5 mL放入EDTA抗凝管，采用密度法分离淋巴细胞，依据试剂盒说明书提取淋巴细胞DNA，采用Epigentek公司甲基化试剂盒检测全基因组DNA甲基化水平[14]。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 两组一般资料比较

两组患者性别、年龄、身体质量指数、收缩压、舒张压、吸烟史等一般资料比较差异均无统计学意义(见表1)。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组血浆Hcy、SAH、DNMTs及外周血淋巴细胞全基因组甲基化水平比较

与对照组比较，观察组血浆Hcy含量、SAH含量显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，观察组血浆DNMTs含量、全基因组甲基化水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 两组血浆Hcy、SAH、DNMTs及外周血淋巴细胞全基因组甲基化水平比较

2.3 相关性分析

对照组Hcy与SAH无相关性(r=0.236 5，P=0.235)；观察组Hcy与SAH呈正相关(r=0.857 0，P<0.05)。观察组Hcy与外周血淋巴细胞基因组甲基化水平呈负相关(r=-0.757，P<0.05)，SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化水平呈负相关(r=-0.94，P<0.05)，相关系数比较SAH与外周血淋巴细胞基因组甲基化水平的相关性要高于Hcy(Z=4.756，P<0.01)。观察组Hcy与DNMTs呈负相关(r=-0.537，P<0.01)，SAH与DNMTs呈负相关(r=-0.672，P<0.01)，相关系数比较SAH与DNMTs的相关性高于Hcy(Z=7.745，P<0.01)(见表3)。

表3 两组Hcy、SAH与DNMTs、外周血淋巴细胞甲基化水平相关性分析

3 讨 论

Hcy增高被认为是冠心病的独立高危因素之一，对于这一观点目前仍存在争议。来自维生素干预脑卒中预防试验(VISP)、挪威维生素试验(NORVIT)、心脏结局预防评估试验2(HOPE-2)等研究提示，通过补充维生素B和叶酸降低了血浆Hcy水平，但对冠心病危险没有明显影响[3-4]。在一项前瞻性队列研究中，在校正Hcy后，SAH与心脏事件风险呈正相关，而校正SAH后，Hcy与心血管事件风险并无相关性[15]，因此有人提出Hcy的毒性来自于SAH的积累，Hcy可能是冠心病的标志物而不是原因，对于冠心病的预测SAH比Hcy更为敏感[16]。SAH是Hcy的前体物质，在SAH水解酶(SAHH)作用下转变成Hcy，该反应是可逆的，Hcy增高可使反应向SAH合成的方向进行导致其增高[17]。在本研究中，与对照组相比，观察组血浆Hcy水平和血浆SAH水平均显著增高，相关性分析提示Hcy与SAH呈正相关性。

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下，以SAM为甲基供体，将活化的甲基引入胞嘧啶的第五位碳原子上，在不改变DNA碱基序列的基础上使DNA修饰发生变化从而调控基因的表达。多项研究证实，冠心病发病风险与基因组DNA甲基化改变有关，然而研究结果不尽相同。动物实验显示，高蛋氨酸饲养载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠的外周血细胞基因组DNA甲基化水平降低，与Hcy呈负相关[6]。还有研究显示，高蛋氨酸喂养ApoE-/-小鼠主动脉DNA甲基转移酶1(DNMT1)活性和DNA基因组甲基化水平与其血浆SAH水平呈负相关[7]，提示基因组DNA甲基化水平与Hcy和SAH均有关。Castro等[8]对17 例心血管疾病患者(8 例脑卒中和9 例心肌梗死患者)研究发现，外周血白细胞基因组甲基化水平明显下降，并且与Hcy和SAH均呈负相关。在新加坡华人中的研究表明，基因组DNA甲基化水平的升高与冠心病密切相关[18]。印度人群的冠心病患者与正常健康人相比，冠心病患者的总体DNA甲基化程度要明显高于对照组，而且冠心病患者血清中的同型半胱氨酸水平明显高于对照组[19]。

基因组甲基化水平与Hcy和SAH水平有关。SAM脱去甲基后转化为SAH，SAH可结合到DNMTs的催化区，导致其结构改变、活性降低，继而影响了DNA的甲基化水平。本研究观察组基因组甲基化水平与Hcy和SAH呈负相关，且SAH与基因组甲基化水平的相关性高于Hcy；观察组DNMTs降低，与Hcy和SAH呈负相关，且SAH与DNMT1的相关性高于Hcy，由此可见，在冠心病患者中，SAH与外周血淋巴细胞的基因组甲基化相关性强于Hcy，与累积的SAH直接抑制DNMTs有关，SAH是比Hcy更为敏感的指标。

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2017-07-10

(本文编辑：王作利)

TherelationshipbetweenperipheralbloodlymphocytesglobalDNAmethylationandplasmaHcyandSAHinpatientswithcoronaryarterydisease

LI Li1，GAO Shengli1，2，ZAI Xiaojuan1，GUO Renwei1，LI Shufeng3

(1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China；2.Fenyang College of Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China；3.Chinese Academy of Medical Sciences in Institute of Medical Information，Beijing 100020，China)

Objective：To research the correlation between peripheral blood lymphocytes global DNA methylation and plasma homocysteine(Hcy) and S-adenosyl hom ocysteine(SAH) in patients with coronary artery disease.Methods：All 70 cases of patients with coronary heart disease were come form in Cardiovascular Medicine in Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，70 cases of control group were healthy people.Plasma Hcy，SAH and DNMTs levels was detectsd by enzyme-linked immunosorbent assay.Extracting whole blood lymphocyte DNA and Global DNA methylation was detectsd by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Compared with control group，in coronary artery disease group，plasma Hcy levels was significantly increased of coronary heart disease (P<0.05)，the level of SAH was increased significantly (P<0.05)，the content of DNMTs was decreased significantly (P<0.05)，peripheral blood lymphocyte DNA methylation was significantly decreased (P<0.05).In coronary artery disease group，peripheral blood lymphocytes global DNA methylation and Hcy were negatively correlated(r=-0.757，P<0.05)，negatively correlated with SAH (r=-0.94，P<0.01).The correlation of SAH and peripheral blood lymphocytes global DNA methylation is higher than that of Hcy (Z=4.756，P<0.01).DNMTs and Hcy was negatively correlated (r=-0.537，P<0.05)，with SAH was negatively correlated(r=-0.672，P<0.01).The correlation of SAH and DNMTs is higher than that of Hcy (Z=7.745，P<0.01).Conclusion：Peripheral blood lymphocyte Global DNA methylation level was significantly decreased in patients with coronary heart disease，and negatively correlated with Hcy and SAH，The correlation of between SAH and Global DNA methylation is stronger than that of Hcy.

homocysteine；s-adenosylhomocysteine；global dna methylation

R541.4

A

1671-8631(2017)12-0899-05

〔1〕本课题为山西医科大学汾阳学院校级基金(课题编号：1406)

*本文通讯作者：高胜利

李莉(1968— )，女，山西省汾阳市人，学士学位，主任医师。研究方向：冠心病表观遗传机制与治疗。