磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对鲤仔鱼的急性毒性试验

张孟丹，梁俊平，李芳芳，程利娇，聂国兴

（河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007）

磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对鲤仔鱼的急性毒性试验

张孟丹，梁俊平，李芳芳，程利娇，聂国兴

（河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007）

为评价磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星两种水产常用药物对鲤鱼仔鱼的毒性强度，在水温26℃条件下，根据改良寇氏法，进行了磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对鲤鱼仔鱼急性毒性试验。结果显示，磺胺二甲嘧啶对鲤鱼仔鱼的24 h和48 h的半致死质量浓度分别为862.56 mg/L、752.43 mg/L，鲤仔鱼磺胺二甲嘧啶安全质量浓度为196.91 mg/L。恩诺沙星对鲤仔鱼24 h和48 h致死质量浓度分别为746.75 mg/L、713.61 mg/L，鲤仔鱼恩诺沙星安全质量浓度为204.58 mg/L。

磺胺二甲嘧啶；恩诺沙星；鲤鱼；急性毒性；半致死浓度；安全浓度

黄河鲤（Cyprinus carpio），属鲤形目、鲤科、鲤亚科，是我国重要淡水经济鱼类，是我国宝贵的鱼类资源[1-2]。近年来，黄河鲤的饲养模式以节约化池塘养殖为主，养殖户高密度的放养苗种、大量投饲、投喂高营养饲料等，使单位面积产量获得大量提高[3]，然而，随之病害也频繁发生，如近年来爆发的鲤鱼烂鳃病，给黄河鲤养殖业造成了巨大的经济损失。养殖户不得不使用各种药物用来减少损失、获得养殖成功[4]。然而由于养殖户缺乏科学的用药技术，加之许多药物是从兽药中移植过来，缺乏科学用药指导，在水产养殖生产中存在一定的用药误区，因而给黄河鲤的健康养殖业带来了潜在风险，给黄河鲤质量安全埋下了隐患。

磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）和恩诺沙星（Enrofloxacin）是目前鲤鱼养殖生产中常用的化学合成抗菌药，对大多数革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌都有抑制作用，广泛用于治疗养殖鱼类中常见的疾病，如细菌性出血败血症、赤皮病、烂鳃病、打印病等[5-8]。磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星在治疗成鱼时多拌在饲料中投喂，在治疗仔鱼时多以药浴形式，而针对磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对鲤鱼仔鱼的安全质量浓度方面的研究鲜有报道。本试验研究了磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对黄河鲤仔鱼的毒性效应，确定其安全质量浓度，旨在为磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星在水产养殖业中的应用提供技术参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验鱼

试验所用的鲤鱼仔鱼为水产学院实训基地室内人工繁育获得，挑选其中健康活泼、大小一致的试验用鱼若干尾，仔鱼平均体长为6.01±0.53 mm。

1.2 试验药物

磺胺二甲嘧啶钠注射液（1 g/10 mL）购于株洲市神农动物药业有限公司，恩诺沙星注射液（5 g/100 mL）购于拜耳（四川）动物保健有限公司。

1.3 养殖条件

鲤鱼仔鱼养殖在2000 mL容器中，养殖温度为26℃，连续充氧。

1.4 试验方法

1.4.1 上限剂量和下限剂量确定

分别配制磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星最大质量浓度，然后按等比关系（如2：1）稀释成多个剂量，每组取5-10尾鱼，按估计剂量试验，观察24-96 h，如果全部死亡则降低剂量，如果全部存活则增加剂量，找出鲤仔鱼100%和0%死亡的剂量，即上限剂量（Dm）和下限剂量（Dn）。经过预试验确定磺胺二甲嘧啶的Dm、Dn分别为1200 mg/L和600 mg/L，恩诺沙星的Dm、Dn分别为 1200 mg/L、Dn为 800 mg/L。

1.4.2 试验分组数及剂量确定

各组剂量要按等比级数排列，根据下列公式求出公比r：

D2=D1·r，D3=D2·r，……Dm=Dn-1·r

其中：G为试验组数，D1=Dn=最小剂量，Dm=最大剂量

1.4.3药物浓度梯度设置

根据预试验分别设置磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星浓度梯度，每个浓度梯度设3个重复，每个重复20尾鱼。24 h更换一次新配制的药物溶液。

磺胺二甲嘧啶的6个质量浓度梯度依次为：600 mg/L、689 mg/L、792 mg/L、910 mg/L、1045 mg/L 和1201 mg/L，养殖水体为1000 mL；恩诺沙星的9个质量浓度梯度依次为：628 mg/L、681 mg/L、738 mg/L、800 mg/L、867 mg/L、940 mg/L、1019 mg/L、1105 mg/L和1197 mg/L，养殖水体为1000 mL。1.4.4 死亡率统计及安全浓度计算

定时记录 24 h、48 h、72 h、96 h 鲤鱼仔鱼的死亡数，计算出死亡率，再根据改良寇氏法求出24 h、48 h、72 h、96 h 的半致死质量浓度（LC50），最后按下式求其半致死质量浓度（LC50）[9]：

Xm=最大剂量的对数值

i=相邻两组比值的对数（lgr）

P=各组死亡率

ΣP=各组死亡率总和

根据特伦堡（Tumbell）公式计算安全质量浓度：

2 试验结果

2.1 磺胺二甲嘧啶对鲤仔鱼死亡率的影响

如图1所示，不同浓度下，24 h的死亡率分别为10.00% 、18.33% 、23.33% 、43.33% 、93.33% 和 100.00%，48h时的死亡率分别为33.33%、36.67%、43.33%、76.68%、96.67%和100.00%；而72和96 h的死亡率在低浓度下均已高于80.00%，甚至达90.00%以上。由此可见24 h、48 h时鲤鱼仔鱼的死亡率随着磺胺二甲嘧啶浓度升高而增加，呈现浓度效应。在质量浓度相同条件下，攻毒时间越长，鲤鱼仔鱼的死亡率越高，特别是72 h和96 h的死亡率在低浓度下已高于80.00%。这可能是由于磺胺二甲嘧啶在鲤鱼仔鱼体内的蓄积超出了黄河鲤鱼仔鱼对磺胺二甲嘧啶的排泄能力，进而影响了鲤鱼仔鱼的正常生理功能，从而导致仔鱼中毒死亡。

图1 磺胺二甲嘧啶对鲤鱼仔鱼死亡率的影响Fig.1 Effects of sulfamethazine on mortality rates ofCyrinus carpio fry

2.2 磺胺二甲嘧啶对鲤仔鱼的半致死质量浓度和安全质量浓度

鲤鱼仔鱼24h和48 h磺胺二甲嘧啶的半致死质量浓度分别为862.56 mg/L和752.43 mg/L，根据公式计算得出磺胺二甲嘧啶的安全质量浓度为196.91mg/L（表 1）。

表1 磺胺二甲嘧啶对鲤鱼仔鱼的半致死质量浓度和安全质量浓度（mg/L）Tab.1 The LC50and SC of sulfamethazine toCyrinus carpio fry

2.3 恩诺沙星对鲤仔鱼死亡率的影响

如图2所示，在相同时间内，随着恩诺沙星浓度越高，鲤鱼仔鱼的死亡率越来越高，24 h时鲤鱼仔鱼的死亡率分别为 18.33%、38.33%、41.67%、76.67%、83.33%、88.33%、93.33%、95.00%和 100.00%，48 h时鲤鱼仔鱼的死亡率分别为21.67%、41.67%、53.33%、86.67%、93.33%、95.00%、100.00%、100.00%和100.00%。恩诺沙星质量浓度相同条件下，攻毒时间越长，鲤鱼仔鱼的死亡率越高，例如，当恩诺沙星的质量浓度为628 mg/L时，鲤鱼仔鱼在72 h、96 h的死亡率已达75.00%、91.67%，而24 h、48 h的死亡率只有18.33%、21.67%。这可能是由于恩诺沙星在鲤鱼仔鱼体内的蓄积已超出鲤鱼仔鱼对恩诺沙星的排泄能力，影响了仔鱼的正常生理功能，从而导致其中毒死亡。

图2 恩诺沙星对鲤鱼仔鱼死亡率的影响Fig.2 Effects of enrofloxacin on mortality rates of Cyrinus carpio fry

2.4 恩诺沙星对鲤鱼仔鱼的半致死浓度和安全浓度

恩诺沙星对鲤鱼仔鱼在24 h和48 h的半致死质量浓度分别为746.75 mg/L、713.61 mg/L，恩诺沙星对鲤鱼仔鱼的安全质量浓度为204.58 mg/L（表2）。

表2 恩诺沙星对鲤鱼仔鱼的半致死质量浓度和安全质量浓度（mg/L）Tab.2 The LC50 and SC of enrofloxacin to Cyrinus carpio fry

3 讨论

3.1 磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对鲤仔鱼的毒性

关于磺胺类药物对水产动物急性毒性研究相对较少，但一般认为磺胺类药物对鱼类毒性较小，安全质量浓度都高于10 mg/L[10]。研究也发现，喹诺酮类药物对鱼类毒性相对较小，如盐酸环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星对孔雀鱼的安全质量浓度分别高达300、200、25 mg/L[11]，氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星对金鱼的安全质量浓度为100 mg/L[12]。与抗菌药物相比，杀虫类农药对鱼类毒性相对较强。王军等[13]研究表明，菊酯类对农药鲤幼鱼96 h LC50仅为0.33 μg/L，安全质量浓度为 0.033 μg/L。徐文彦等[14]研究表明，阿维菌素和甲苯咪对鲤幼鱼的安全质量浓度分别为1.91 μg/L、1.23 mg/L。福瑞鲤幼鱼对硫酸铜、敌百虫的安全质量浓度分别为0.17 mg/L、8.05 mg/L[15]。本研究结果显示，磺胺二甲嘧啶对鲤仔鱼24 h LC50和48 h LC50分别为862.56 mg/L、752.43 mg/L，安全质量浓度为196.91mg/L；恩诺沙星对鲤仔鱼24 h LC50和48 h LC50分别为746.75 mg/L、713.61 mg/L，安全质量浓度为204.58 mg/L。刘艳辉等[16]研究结果显示，恩诺沙星对德国框镜鲤夏花鱼种24 h LC50和48 h LC50分别为693 mg/L、629 mg/L，安全质量浓度为155 mg/L。由此看出，在本实验条件下，磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星对鲤仔鱼的毒性相对较弱。

3.2 磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星抑菌作用与科学用药

磺胺药物结构与对氨苯甲酸相似，可与对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，阻碍二氢叶酸的合成，从而起到抑菌作用、达到疾病治疗效果[10]。磺胺二甲嘧啶对嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌(Vibrio anguillurum)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiela tarda)的 MIC 均为 0.20 mg/L[17]；而林春友等[18]研究结果显示磺胺二甲嘧啶对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)不同菌株的MIC均大于128 mg/L，一般认为磺胺二甲嘧啶致病菌的MIC多为10-50 mg/L[19]。恩诺沙星通过与细菌DNA回旋酶亚基A结合，抑制该酶的活性，影响DNA复制过程，从而起到抑菌和杀菌作用。恩诺沙星对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的MIC为 0.16-0.50 mg/L[20-21]，对苏伯利产气单胞菌(Aeromonas sobria)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和粘球菌(Myxococcus piscicola)等的MIC为0.02-0.63 mg/L[22]。对于常见淡水鱼类细菌疾病，建议恩诺沙星药浴剂量为4 mg/L，而关于磺胺二甲嘧啶药浴剂量尚未有明确规定[19]。本研究结果显示，鲤仔鱼对磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星安全质量浓度远远大于抑菌浓度。因此，对于鲤仔鱼疾病防治而言，磺胺二甲嘧啶和恩诺沙星使用量只要达到抑菌浓度即可，且不会对仔鱼产生毒性。特别注意的是，在疾病防治过程中应避免过量用药，过量药物不仅会使人类病原菌产生耐药性，同时过量残留在水产品中的药物会对人体产生溶血性贫血、再生障碍性贫血等危害[23]。水产科技工作者应广泛宣传科学用药规范，对养殖户进行技术培训，提高养殖户科学用药意识和技术水平，从而促进水产养殖健康可持续发展、提升水产品质量安全水平。

[1]陈丽丽,王松涛,杜启艳,等.黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达[J].安徽农业科学,2009,37(14)：6369-6371,6386.

[2]杨太有,王琳,李仲辉,等.池养黄河鲤鱼 含肉率及其肌肉营养成份的分析[J].海洋湖沼通报,1996(4)：55-59.

[3]郭国军,徐文彦,王先科.集约化池塘养殖黄河鲤生产误区及其改进建议[J].科学养鱼,2012(2)：22-23.

[4]唐国盘,张晓芳.一例黄河鲤鱼急性烂鳃病的诊治[J].科学养鱼,2013(1)：66.

[5]张长坤,王茂剑,宫向红,等.磺胺二甲嘧啶在大菱鲆体内的药代动力学研究[J].海洋湖沼通报,2010(2)：86-90.

[6]李在建,吴玉荣,易维学,等.三种不同磺胺类药物对鲤鱼肝细胞色素P450酶系生化指标的影响[J]. 中 国 兽 医 科 学 ,2010,40(9)：970-974.

[7]梁俊平,李健,张喆,等.肌注和口服恩诺沙星在大菱鲆体内的药代动力学比较[J].水生生物学报,2010,34(6)：1122-1129.

[8]Liang J P,Li J,Zhao F Z,et al.Pharmacokinetics and tissue behavior of enrofloxacin and its metabo lite ciprofloxacin in turbot Scophthalmus maximus,at two water temperatures[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2012,30(4)：644-653.

[9]雷衍之.养殖水环境化学(水产养殖专业用)[M].北京：农业出版社,2004.

[10]巢磊.磺胺类药物在水产养殖中的应用[J].水生态学杂志,2002,22(3)：50-51.

[11]房英春,齐跃,李莹,等.盐酸环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星对孔雀鱼急性毒性试验研究[J].沈阳大学学报(自然科学版),2012,24(3)：15-17.

[12]毕田田,赵海燕,张双灵.氧氟沙星乳酸诺氟沙星和恩诺沙星对金鱼的急性毒性试验研究[J].农产品加工月刊,2015(8)：31-33.

[13]王军,霍军,程会昌,等.不同浓度菊酯类农药对黄河鲤鱼的急性毒性试验和MDA活性的影响[J].江西农业学报,2011,23(2)：137-139.

[14]徐文彦,郭国军,齐子鑫,等.阿维菌素和甲苯咪唑对黄河鲤的急性毒性研究[J].淡水渔业,2011,41(2)：88-91.

[15]薛凌展,樊海平,吴斌.6种常用渔药对福瑞鲤的急性毒性试验[J].福建水产,2012,34(4)：296-301.

[16]刘艳辉,祖岫杰,李改娟,等.恩诺沙星对鱼类的急性毒性研究[J].吉林水利,2012(6)：46-47.

[17]陈超然,范盛先,袁宗辉,等.喹赛多对鱼类常见致病菌的试管内抑菌作用[J].华中农业大学学报,2001,20(5)：466-468.

[18]林春友,王云祥.淡水养殖鱼类病原菌药敏实验[J].水生态学杂志,2004,24(3)：58-59.

[19]杨先乐.新编渔药手册.北京：中国农业出版社，2005.

[20]陈俭清,卢彤岩,刘红柏,等.恩诺沙星对嗜水气单胞菌的体外药效学研究[J].水产学杂志,2010,23(1)：47-50.

[21]Maluping RP,Lavilla-Pitogo CR,DePaola A,et al.Antimicrobial susceptibility ofAeromonasspp.,Vibriospp.andPlesiomonas shigelloidesisolated in the Philippines and Thailand[J].Inter national Journal of Antimicrobial Agents,2005,25(4)：348-350.

[22]张雅斌,刘艳辉,张祚新,等.恩诺沙星在鲤体内的药效学及药动力学研究[J].大连海洋大学学报,2004,19(4)：239-242.

[23]常志强,李健,刘萍.磺胺二甲嘧啶的危害特征[J].中国渔业质量与标准,2012,2(4)：15-20.

Acute toxicity test of sulfamethazine and enrofloxacin on the fry ofCyrinus carpio

Zhang Mengdan,Liang Junping,Li Fangfang,Cheng Lijiao,Nie Guoxing

(College of Fisheries,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

In order to evaluate the toxicity of sulfamethazine and enrofloxacin on the fry ofCyrinus carpio,the acute toxicity test of sulfamethazine and enrofloxacin toC.carpiofry was made by using the improved Karber's method,at the water temperature of 26℃.The results showed that the 24h and 48h median lethal concentrations of sulfamethazine were 862.56 mg/L,752.43 mg/L,and the safe concentration of sulfamethazine was 196.91 mg/L.The 24h and 48h median lethal concentrations of enrofloxacin were 746.75 mg/L,713.61 mg/L,and the safe concentration of enrofloxacin was 204.58 mg/L.

sulfamethazine;enrofloxacin;Cyrinus carpio;acute toxicity;median lethal concentration;safe concentration

国家自然科学基金资助项目（31502185）；河南省科技攻关项目（142102310037）

张孟丹（1992-），女，硕士研究生，研究方向：水产动物营养与安全

聂国兴（1971-），男，教授，研究方向：水产动物营养与饲料科学，E-mail：niegx@htu.cn