三氯生对斑马鱼微核率和核异常率的影响

刘旭昊，汪小将，王 凡

（洛阳师范学院生命科学学院，河南洛阳471934）

三氯生对斑马鱼微核率和核异常率的影响

刘旭昊，汪小将，王 凡

（洛阳师范学院生命科学学院，河南洛阳471934）

为了探讨三氯生（TCS）对鱼类遗传毒性，通过半静态水质接触染毒法对斑马鱼进行染毒，设置对照组和三个不同浓度组（0.017 mg/L、0.034 mg/L、0.068 mg/L）的TCS处理组，染毒28 d后，测定斑马鱼外周血红细胞的微核率和核异常率。结果显示：TCS各处理组红细胞的微核率和核异常率显著升高（P＜0.01），且随着TCS浓度的增大而增大，呈现一定的剂量-效应关系。以上结果表明：TCS对斑马鱼具有潜在的遗传毒性。

三氯生；斑马鱼；红细胞；微核；核异常

三氯生（Triclosan，TCS），又名三氯新或者三氯沙，不溶于水，是一种广谱抗菌剂，广泛应用于医疗消毒和日化产品如香皂、牙膏、洗面奶等中，随着生活污水进入自然水体，在城市排水系统、污水处理系统、污泥、河流等水体均可检测到其存在[1-4]。随着TCS的应用量增加，自然水体TCS的存量随之增加，动植物甚至人体也开始发现并蓄积。因其数量巨大、相对难以降解、生物富集作用、对动植物乃至人体的潜在危害，越来越引起学者们的重视[5]。

由于TCS在污水处理厂不易被处理，因此污水处理厂的出水排放是TCS进入水环境的主要途径，从而导致水生生物处于潜在的生态风险中，国内外大量研究表明，TCS对水生生物具有致死、免疫、内分泌干扰等效应。关于TCS对水生生物遗传毒性的研究较少，且出现不同的结果。刘飞等[6]的研究结果表明，TCS对红白鲫具有遗传毒性；Rodricks等[7]通过TCS对经典原核生物和真核生物的研究表明其没有遗传毒性。

斑马鱼是一种模式动物，因其基因与人类有着高达87%的同源性，大多数试验结果适用于人类，且易饲养、繁殖快、对污染物的作用敏感，同样可作为水质监测、研究的模式生物[8]。因此，以斑马鱼为试验材料，通过检测其外周血红细胞微核率和核异常率，来探讨TCS遗传毒性，为三氯生的合理应用、毒理研究、环境评价、治理标准等提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验用斑马鱼购自上海观赏鱼养殖中心，体长约2.6～3.1 cm；暂养于实验室玻璃水族箱中驯化14 d，24 h不间断充氧，每日定时投喂饵料一次，过滤除去饵料残渣、排泄物等，每日更换曝气72 h的自来水，水温 22±3℃，pH 值 6.9±0.2，不间断充氧确保溶氧量＞5 mg/L。然后取大小相近、行为敏捷、无病无伤的斑马鱼分组，在60 L玻璃水族箱中进行试验。

三氯生（TCS）购自绿森化工有限公司、纯度99.5%；吉姆萨原液（Solarbio公司）、二甲基亚砜（分析纯）、甲醇（分析纯）。以二甲基亚砜为助溶剂，配制浓度为2 g/L的母液，根据实际用水量配制染毒液。吉姆萨原液染色前用配套稀释液稀释备用。

1.2 毒性试验

通过查阅相关资料可知，斑马鱼96 h LC50为0.34 mg/L[9]。以此为依据，设置对照和3个TCS处理组（浓度分别为 0.017 mg/L、0.034 mg/L、0.068 mg/L），每组设2个平行。每个水族箱试验用水20 L，投放30尾斑马鱼；水温、pH值、溶氧等参数维持驯化时的数值。然后以半静态染毒法对斑马鱼进行染毒，每天换水一次，定时投喂一次并及时捞出死亡个体。

1.3 血涂片制作和数据采集

28 d后每组随机取5尾斑马鱼，断尾采血，制作常规血涂片，甲醇固定15 min，吉姆萨染色10 min，磷酸缓冲液漂洗。然后将染色血涂片放在Motic-BA600Mot全自动显微镜下观察、扫描、拍照，每尾斑马鱼血涂片随机计数观察5000个红细胞，记录并统计微核数和核异常红细胞数，最后计算出核异常率，结果用千分率（‰）表示。计算公式如下：

微核率=微核总红细胞数/观察总红细胞数×1000‰

核异常率=核异常的总红细胞数/观察总红细胞数×1000‰

1.4 数据分析

用统计软件spss13.0分析处理数据，进行单因素方差分析和LSD法多重比较，记录的数据用平均值±标准误来表示，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 TCS对斑马鱼血红细胞形态的影响

正常斑马鱼的外周血红细胞大多数为椭圆形，少数为圆形，细胞膜圆滑而清晰；核区椭圆型，基本位于细胞中央，清晰可辨，经吉姆萨染色后显蓝色微偏紫色。胞质着色淡，近乎透明。而TCS处理的斑马鱼红细胞出现异常，包括微核、不均等缢裂、核位异常、核内空泡化、双核、核不规则、核质外凸、核质内凹、核碎裂等，其中微核、红细胞核质外凸、核质内凹及核内空泡化比较常见。

2.2 三氯生对斑马鱼红细胞微核率和核异常率的影响

TCS对斑马鱼外周血红细胞微核率和总核异常率的影响结果见图1。正常斑马鱼有少量外周血红细胞出现微核，其空白对照组的微核率为0.49±0.10‰，经28 d TCS染毒后，TCS浓度为0.017 mg/L的实验组微核率为1.29±0.20‰，0.034mg/L实验组微核率为1.59±0.20‰，0.068 mg/L实验组微核率为1.99±0.20 ‰，与对照组相比显著升高（P＜0.01）。且随着TCS浓度的升高，微核率逐渐升高，呈现一定的剂量效应关系。

空白对照组的核异常率为1.45±0.12‰，TCS浓度为0.017 mg/L的染毒组核异常率为2.25±0.11‰，浓度是0.034 mg/L的染毒组核异常率为2.83±0.23‰，浓度是0.068 mg/L的染毒组核异常率为3.33±0.10‰，与对照组相比较，显著升高（P＜0.01）。且随着TCS浓度的升高，总核异常率也逐渐升高，呈现一定的剂量效应关系。

图1 TCS对斑马鱼外周血红细胞核异常率和微核率的影响

3 讨论

作为食物链中连接人类和水体污染的媒介，水生生物，尤其是对外源毒物的反应机制和生物富集类似于哺乳动物的鱼类[10]，可以快速测出水环境中的遗传毒物，所以常用鱼类作为水环境监测的生物。多种化学物质处理水生生物都能使其产生微核。微核是一种染色体异常现象[11]，关于微核是如何产生的，大部分的学者虽然有不同的表达方式，但基本观点是相同的。一般认为，生物体由于化学毒性物质损伤、放射性照射、细胞组成成分缺乏等原因，在分裂间期细胞的染色体受到损伤，分裂中期时染色体断裂，在细胞分裂的后期，向两极移动的染色体早于这些断裂的碎片，碎片因而在赤道板附近滞留，当其他染色体形成子细胞核的时候，落后的碎片就形成了微核。

本研究中TCS处理组均对斑马鱼血液红细胞产生了影响，且发现血液红细胞中出现了大微核、小微核和双微核，可能是由于斑马鱼在水中受到TCS的作用，使染色体损伤、断裂而导致。试验结果还发现斑马鱼血液红细胞微核率随着TCS浓度的增加而升高，斑马鱼血液红细胞微核率与TCS浓度之间存在一定的效应-剂量关系。王杨科等[12]研究镉对泥鳅红细胞微核的影响、李倩等[13]研究Cu2+对泥鳅血液红细胞微核的影响以及耿德贵等[14]研究乙草胺对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞微核的影响和本试验结果类似。

对于TCS而言，其遗传毒性可能跟它的降解产物有关，比如TCS在光催化过程中就能产生二噁英和三氯甲烷等具有遗传毒性的物质[15]；研究表明生物富集作用亦可能和遗传毒性存在正相关[16]，所以也可能是因为TCS的富集作用在斑马鱼体内积累，从而对鱼类红细胞的遗传物质造成损伤，破坏染色体的结构，最终造成微核和核异常率增加。也有实验表明活性氧自由基的产生和累积也会产生遗传毒性，因为活性氧自由基可以导致DNA断裂，这是微核和核异常形成的直接原因[17]。

三氯生对斑马鱼具有明显的遗传毒性，说明对人类存在重大潜在遗传毒性的可能。随着三氯生的环境存量日益增加，需要通过深入研究明确其对环境动植物和人体的遗传毒性、生态毒性和生理毒性。

[1]宋燕.掺杂石墨烯气体扩散电极电—Fenton法处理三氯生模拟废水的研究[D].大连：大连理工大学,2013.

[2]Dhillon G S,Kaur S,Pulicharla R,et al.Triclosan：current status,occurrence,environmental risks and bioaccumulation potential[J].International Journal of Environmental Researchamp;Public Health,2015,12(5)：5657-5684.

[3]Corteza F S,Seabra Pereira C D,et al.Biological effects of environmentally relevant concentrations of the pharmaceutical triclosan in the marine mussel Perna perna(Linnaeus,1758)[J].Environmental Pollution,2012,168(5)：227-233.

[4]周雪飞,陈家斌,周世兵,等.三氯生检测方法的建立与优化[J].中国给水排水,2010,26(12)：126-129.

[5]高海萍,周雪飞,张亚雷,等.三氯生对水生生物的毒性效应研究进展[J].环境化学,2012,31(8)：1145-1150.

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[8]李汝，逯南南，李梅等.斑马鱼生物学效应的研究进展及在水质监测中的应用[J].供水技术，2014,8(6)：7-12.

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[10]刘楠楠，吕碧平，厉以强，等．稀有鮈鲫血液红细胞微核试验方法研究[J]．中国环境监测，2012，28(3)：121-126．

[11]龚婧婧，黄海涛，米其利,等.微核技术研究进展[J].生物技术通报,2012,3：49-56.

[12]王杨科，王琦，路宏朝.镉对鲫鱼和泥鳅外周红细胞微核的诱导效应[J].江苏农业科学，2012,40(3)：203-205.

[13]李倩,胡廷尖,王雨辰,等.Cu2+对泥鳅外周血红细胞微核及核异常的影响[J].水产养殖,2011,32(10)：44-47.

[14]耿德贵,张大生,程伟,等.四种除草剂对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞微核及核异常的影响[J].动物学杂志,2000,35(1)：12-16.

[15]曹光群,陈忠良,宋启军.三氯生的光降解产物分析及相关日化产品的安全性研究[J].分析试验室,2008,27(8)：58-61．

[16]张曙光.黄河重金属污染物对鱼类的致突变性研究[J].环境科学研究，1996,9(3)：51-57.

[17]胡国成,甘炼，吴天送,等.硫丹对斑马鱼的毒性效应[J].动物学杂志,2008,43（4）：1-6.

Effects of triclosan on micronuclei and nuclear anomalies in erythrocyte of zebrafish

Liu Xuhao,Wang Xiaojiang,Wang Fan

(Department of life science,Luoyang normal university,Luoyang 471934,Henan,China)

To explore the genotoxicity of triclosan to fish,zebrafish were exposed to blank control and three different doses of triclosan solution(0.017 mg/L,0.034 mg/L,0.068 mg/L)by semi-static water contracting contamination method for 28 days.Then,we studied the effects of triclosan on blood erythrocytes micronucleus and nuclear anomalies rate in the zebrafish.It was showed that the micronuclei and nuclear anomalies were significantly increased with the increasing of triclosan concentration(P＜0.01).In addition,there was a dose-effect relationship between triclosan dose and micronuclei,nuclear anomalies.These findings suggested that the triclosan had a potential genotoxicity on zebrafish.

triclosan;zebrafish;rbc;micronucleus;nuclear anomaly

NSFC-河南人才培养联合基金(U1504303)；河南省高等学校青年骨干教师培养计划项目（2016GGJS-119）

王凡，E-mail：31734115@qq.com