老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的相关性

王庆西

(山东大学附属济南市中心医院，山东 济南 250013)

老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的相关性

王庆西

(山东大学附属济南市中心医院，山东 济南 250013)

目的分析老年宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒(HPV)16-E6、p53 mRNA表达及其与放疗敏感性的关系。方法40例宫颈癌患者均按计划进行根治性放射治疗前后采用实时定量反转录聚合酶链反应(PT-PCR)检测宫颈癌组织中HPV16-E6、p53 mRNA的表达水平，并根据治疗结果分为有效组29例和无效组11例，分析HPV16-E6、p53与放疗敏感性的关系。结果治疗总有效率为72.50%；放疗前后无效组2例HPV16-E6、p53 mRNA和蛋白差异无统计学意义(Pgt;0.05)，放疗前后有效组4例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表达水平明显改善，HPV16-E6蛋白表达水平显著低于无效组，p53蛋白表达水平显著高于无效组(Plt;0.05)。结论HPV16-E6感染、p53基因异常参与了老年宫颈癌发生、发展过程，检测HPV16-E6、p53 mRNA的表达可判断宫颈癌组织放疗敏感性。

宫颈癌；放疗敏感性；人乳头状瘤病毒(HPV)16-E6；p53 mRNA

正常宫颈发展为宫颈癌过程缓慢，其中人乳头状瘤病毒(HPV)感染起一定促进作用〔1〕。目前临床治疗宫颈癌方法包括手术和放射治疗，80%宫颈癌患者需要放疗作为单独治疗或综合治疗的手段。但在临床中发现，部分患者因肿瘤对放射线抵抗导致治疗失败，可能与不同个体对放射线敏感程度存在差异有关〔2〕。评估放疗的敏感性有利于预测肿瘤对放射线反应，合理选择放疗方法，从而提高肿瘤放射治疗的效果。p53属于抑癌基因，过度表达可导致肿瘤细胞放射抗拒。本文分析老年宫颈癌患者HPV16-E6、p53表达及与放疗敏感性的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料 2015年11月至2016年11月山东大学附属济南市中心医院老年宫颈癌患者40例，年龄61～76岁，平均(66.72±2.03)岁；宫颈癌国际妇产科联盟(FIGO)分期：ⅡA期11例，ⅡB期29例。纳入标准：①经组织病理学确诊为宫颈癌；②经腹部B超、X线胸片、CT或磁共振成像(MRI)检查，证实无远处转移；③首次治疗为单纯根治性放射治疗；④依从性良好，主动配合完成疗程，签署同意书。排除标准：①术前全身化疗、介入化疗、插植放疗等影响术后病理放射敏感性评价结果；②放疗过程中出现严重不良反应者。

1.2放射治疗方法 均接受根治性放射治疗，采用可直线加速器6/10 MV X射线进行外照射，盆腔大野前后两野对穿照射，照射野为(18～20 cm)×(16～20 cm)，2 Gy/次，1次/d，5次/w，盆腔外照射总剂量30 Gy后，将4 cm宽铅块遮挡照射野，保护直肠和膀胱，同时进行后装腔内放疗，6 Gy/次，1次/w，后装剂量控制为36～42 Gy/6～7次，后装放疗当日不行外照射〔3,4〕。

1.3HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表达水平检测 放疗前后均留取癌组织，提出RNA。根据放疗治疗结果，选择有效组4例(标记1、2、3、4)和无效组2例(标记5、6)为检测对象，选取放疗前后癌组织进行检查。同一患者取不同部位3处提取RNA，采用1 μg RNA行反转录反应，获得的cDNA作为PCR模板，随后进行RT-PCR检测。

1.4HPV16-E6、p53蛋白表达水平检测 试剂：ABI 1556试剂盒(美国Ambion)、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(美国Pierce公司)，分别提取组织蛋白和检测组织蛋白浓度。蛋白质溶液中加入4倍上样缓冲液，100℃加热5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质条带，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉进行1 h封闭，经一抗孵育洗膜、二抗室温培养1 h洗膜后，采用发光试剂盒检测荧光。

1.5观察指标 参考《实体瘤新的疗效评价标准》〔5〕中相关宫颈癌疗效判断标准，完全缓解(CR)：病灶消失，且持续≥1个月；部分缓解(PR)：病灶最大径×最大垂直径减少50%以上，且持续≥1个月；稳定(SD)：病灶最大径×最大垂直径减少50%以下，或增加25%以下；进展(PD)：病灶最大径×最大垂直径增加25%以上，或有新病灶出现。根据治疗效果分为有效组(CR+PR)29例和无效组(SD+PD)11例。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1放疗结果 CR 11例，PR 18例，SD 6例，PD 5例，总有效率为72.50%。

2.2放疗前后HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA水平比较 放疗后有效组4例HPV16-E6 mRNA水平(分别为0.243 8±0.003、0.356 7±0.010、0.423 7±0.014、0.247 8±0.017)显著低于放疗前(0.913 5±0.025、0.921 0±0.023、0.902 4±0.024、0.912 3±0.023)，p53 mRNA表达水平(分别为1.897±0.041、1.656±0.042、1.598±0.040、1.698±0.038)显著高于放疗前(1.003±0.063、0.997±0.056、1.005±0.060、1.009±0.063，Plt;0.05)；放疗前后无效组2例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA无显著差异(分别为0.911 1±0.026、0.924 5±0.024 vs 0.879 1±0.025、0.924 6±0.026；0.979±0.062、1.003±0.063 vs 1.048±0.061、0.998±0.064，Pgt;0.05)。

2.3放疗前后HPV16-E6、p53蛋白表达水平比较 放疗前有效组和无效组HPV16-E6、p53蛋白表达水平无显著差异(Pgt;0.05)，放疗前后无效组HPV16-E6、p53蛋白表达水平无显著差异(Pgt;0.05)，放疗后有效组HPV16-E6蛋白水平显著低于放疗前、无效组，p53蛋白表达水平显著高于放疗前、无效组(Plt;0.05)。见表1。

表1 放疗前后有效和无效组HPV16-E6、p53蛋白表达水平比较

与放疗前比较：1)Plt;0.05；与无效组比较：2)Plt;0.05

3 讨 论

据世界卫生组织(WHO)报道〔6〕，全世界每年新增宫颈癌44万人次，发展中国家占80%以上。50～60岁年龄段妇女是宫颈癌高发人群。宫颈癌发生、发展过程十分复杂，涉及多种癌基因、抑癌基因异常。研究显示HPV感染与宫颈癌发生有关。HPV属于一种双链、右手螺旋、嗜上皮性的DNA病毒〔7〕，高危型HPV包括HPV16、HPV18，是宫颈癌发生的独立危险因素，可抑制抑癌基因表达，促进增殖基因表达，与潜在的恶性生物学行为有关。张莉华等〔8〕研究显示，HPV16-E6参与宫颈癌发生、发展、侵袭转移过程。E6转化基因及产物是HPV16致癌的关键，但有关宫颈组织恶性转化机制尚未完全明确。HPV感染所致的高级鳞状上皮内病变中E6、E7蛋白表达水平增高，提示E6、E7表达与细胞恶性病变有关〔9〕。廖百花等〔10〕认为RNA干扰可抑制HPV复制，研究结果表明小鼠宫颈癌细胞瘤体经靶向转染HPV16-siRNA后，HPV16-DNA明显降低，抑制了HPV-DNA的复制，减缓肿瘤生长速度。龙小佳等〔11〕研究表明，HPV16-E6蛋白表达升高、p53蛋白表达降低可导致口腔癌发生发展。p53是一种抑癌基因〔12〕，其基因突变参与了多种恶性肿瘤的发生发展过程。HPV16-E6蛋白与野生型p53蛋白结合，改变p53蛋白分子结构和功能，引起p53诱导G1期阻滞减弱，导致病毒进入S期，一旦细胞增殖失控，将形成肿瘤。

放疗过程中放射线将细胞DNA双链断裂(DSB)，起到杀死肿瘤细胞的目的〔13〕。由于细胞具有不同程度的DNA损伤修复能力，细胞照射后DNA修复能力将影响放疗的效果。细胞修复能力与DSB修复蛋白功能、活性、蛋白自身等因素决定〔14〕。目前多数学者试图通过改进放疗技术或应用化疗药物增敏等提高放疗效果，但宫颈癌内在放射敏感性决定了放疗疗效。张欣欣等〔15〕研究显示，治疗前患者血红蛋白(Hb)含量、肿瘤大小、分化程度、病理类型等是影响宫颈癌放疗敏感性的因素。李雪梅等〔16〕研究表明，CT灌注参数血容量、表面通透性可评估宫颈癌患者放化疗敏感性。传统预测肿瘤放疗敏感性方法是在整体或细胞水平上进行，无法为治疗、评价预后提供足够数据。眭鸿颖等〔17〕研究结果显示，p53蛋白与宫颈癌放疗敏感性有相关性，可作为早期宫颈癌放疗敏感性的预测指标。野生型p53可导致细胞凋亡，一旦p53突变，细胞凋亡将减少，对放疗产生抗拒，降低放疗敏感性。HPV E6基因可与突变的p53基因结合，在突变p53基因发挥作用前灭活，降低p53突变患者恶性病变风险。王媛等〔18〕研究显示，以HPV-18为主的HPV感染可能影响宫颈癌放化疗敏感性。童婷婷等〔19〕研究结果表明，p53高表达与宫颈癌放疗抗拒有关，HPV DNA多重感染的宫颈癌患者对放疗敏感性较差。HPV病毒反复感染，经整合入宿主染色体，编码HPV16-E6蛋白，结合p53蛋白核心区，丧失p53对细胞周期调控作用，导致细胞复制失控，恶性克隆性增殖。梁少强等〔20〕研究表明，CCND1基因G870A位点多态性可作为高危型HPV相关宫颈癌放疗敏感性的预测指标。

本研究提示检测HPV16-E6、p53表达水平不仅有利于确诊宫颈癌，还能判定宫颈癌放疗敏感性。随着立体定向适形、调强放疗技术的不断发展，放疗过程中可更好地保护正常组织，使得肿瘤细胞得到更高的照射剂量。宫颈癌放疗敏感性较差的患者可通过调节HPV16-E6、p53基因表达，增强放疗敏感性，提高临床治疗效果。

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〔2017-08-29修回〕

(编辑 苑云杰)

R737.33

A

1005-9202(2017)22-5622-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.062

王庆西(1963-)，男，副主任技师，主要从事临床检验研究。