白细胞介素-8基因在鼻息肉组织中的表达及对鼻黏膜上皮细胞凋亡的影响

郑慧媛 马新春 石 磊 李建民

(青海大学附属医院耳鼻喉科，青海 西宁 810001)

白细胞介素-8基因在鼻息肉组织中的表达及对鼻黏膜上皮细胞凋亡的影响

郑慧媛 马新春 石 磊 李建民

(青海大学附属医院耳鼻喉科，青海 西宁 810001)

目的探讨白细胞介素(IL)-8基因在鼻息肉组织中的表达及对鼻黏膜上皮细胞凋亡的影响。方法Western印迹检测IL-8在鼻息肉组织及下鼻甲组织中的表达；从鼻息肉组织中分离培养人鼻黏膜上皮细胞(HNEC)，将IL-8小干扰RNA(IL-8-siRNA)和阴性对照(siRNA-NC)转染细胞，以空脂质体转染的细胞作为对照组，Western印迹检测转染效果；各组转染细胞培养48 h后，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，Western印迹检测酶切caspase3蛋白表达。结果IL-8在鼻息肉组织中的表达显著高于下鼻甲组织(Plt;0.01)；siRNA-NC组与对照组差异无统计学意义(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA组显著低于对照组(Plt;0.01)；siRNA-NC组细胞凋亡率及酶切caspase3蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA组均显著高于对照组(Plt;0.01)。结论IL-8在鼻息肉组织中高表达，沉默IL-8的表达能通过上调酶切caspase3蛋白表达促进HNEC凋亡。

白细胞介素-8基因；鼻息肉；鼻黏膜上皮细胞；凋亡

目前鼻息肉发病原因及机制尚不清楚〔1〕。近年来研究发现多种细胞因子参与了鼻息肉的发生发展〔2〕。白细胞介素(IL)-8是一种多源性细胞因子，在炎症和肿瘤中可激活血管内皮细胞及白细胞。IL-8的激活可促进血管内皮细胞的增殖、抑制细胞的凋亡〔1〕。IL-8基因在鼻息肉形成中的作用目前研究尚不清楚。本研究旨在探讨IL-8在鼻息肉组织中的表达及其对鼻黏膜上皮细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1一般材料 收集青海大学附属医院2014年6月至2015年7月手术切除后存档的慢性鼻窦炎鼻息肉组织石蜡包埋标本40例，其中男27例，女13例，年龄20～71岁，中位年龄45.1岁。患者均为首次鼻息肉摘除术，且在术前2 w未使用多抗组胺类药物、糖皮质激素。对照组选择同时期在我院进行鼻中隔矫正术患者的下鼻甲组织，其中男16例，女12例，年龄21～51岁，中位年龄34.2岁。所有样品采集均经过患者及家属的知情同意。试剂和仪器：胰蛋白酶购自美国Sigma；DMEM/F12细胞培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Invitrogen Gibco；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天；IL-8、酶切caspase3单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购于美国 Abcam；细胞凋亡试剂盒购自ACTGene公司；酶标仪购自Thermo Labsystems公司；流式细胞仪购自美国BD；CO2细胞培养箱购自美国SIM公司。

1.2方法

1.2.1IL-8在鼻息肉组织中的表达检测 将鼻息肉组织及下鼻甲组织放入研钵研磨成粉末后，加入适量的裂解液置于冰上反应30 min，4℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清。按照BCA试剂盒操作说明检测提取的蛋白浓度。充分混匀蛋白样品与上样缓冲液，100℃变性5 min，将变性蛋白加入到制好的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶，每孔加入25 μl，电泳结束后取出凝胶，4℃转膜1.5 h，5%的脱脂奶粉封闭聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h，以IL-8单克隆抗体作为一抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，37℃孵育2 h。TBST清洗后加入增强化学发光法(ECL)发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，分析蛋白表达水平。

1.2.2人鼻黏膜上皮细胞(HNEC)的分离培养 取鼻息肉组织，用4℃的PBS多次冲洗后，加入0.25%的胰酶消化16～18 h，制成细胞悬液。锥虫蓝染色法确定细胞的活性后，将细胞悬液稀释为每升含有108个细胞，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养1 h，去除成纤维细胞，转移细胞至6孔细胞培养板中(已加入盖玻片)，加入含有5 mg/L转铁蛋白、5 mg/L胰岛素、10 μg/L霍乱霉素、0.36 mg/L氢化可的松、100 μg/L维生素A酸，20 μg/L三碘甲状腺氨酸、25 μg/L表皮生长因子、3.75 mg/L内皮细胞生长因子的DMEM/F12培养基，隔天换液1次，进行无血清原代培养4～5 d。细胞融合度达到80%以上进行消化传代。

1.2.3细胞转染 取生长至对数期的HNEC，调整细胞浓度为106个/ml，接种于6孔细胞培养板中。每孔加2 ml细胞悬浮液，培养24 h。将对照组(空脂质体转染组)、siRNA-NC(转染100 nmol/L的阳性siRNA)、IL-8-siRNA(转染100 nmol/L的IL-8-siRNA)转染到细胞内，室温放置15 min后，取500 μl转染复合物加入到细胞中，置于37℃，5% CO2的培养箱中培养6 h，更换细胞培养液继续培养。

1.2.4细胞凋亡检测 取转染后的上述3组细胞，以3×104个/ml接种于96孔细胞培养板中，取1 ml细胞悬液转移至离心管中，4℃，1 000 r/min离心8 min，弃上清，加入提前预冷的PBS 3次洗涤细胞后，在细胞沉淀中加入200 μl缓冲液，加入 PI和 Annexin-V各5 μl，充分混匀后放置避光条件下反应20 min，加400 μl缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5Western印迹检测酶切caspase3蛋白表达 取转染后培养48 h的1.2.3中的3组细胞，适量的Trizol置于冰上裂解反应30 min后，4℃，12 000 r/min离心15 min，吸取蛋白上清液，BCA试剂盒检测提取的蛋白浓度。按照1.2.1检测酶切caspase3蛋白表达。

1.3统计学方法 应用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1IL-8在鼻息肉组织中的表达 IL-8在鼻息肉组织中的表达(0.468±0.035)显著高于下鼻甲组织(0.162±0.023，Plt;0.01)。见图1。

2.2IL-8在转染后细胞中的表达 siRNA-NC组细胞中IL-8蛋白表达(0.606±0.035)与对照组(0.611±0.039)差异无统计学意义(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA组(0.224±0.023)显著低于对照组(Plt;0.01)。见图2。

2.3IL-8对HNEC凋亡的影响 siRNA-NC组细胞凋亡率〔(2.28±0.92)%〕及酶切caspase3蛋白表达(0.092±0.009)与对照组〔(2.23±0.77)%，0.108±0.010〕比较差异不显著(Pgt;0.05)，IL-8-siRNA组细胞凋亡率〔(15.12±1.43)%〕及酶切caspase3蛋白表达(0.311±0.029)显著高于对照组(Plt;0.01)，见图3。

图1 IL-8在鼻息肉组织及下鼻甲组织中的表达

图2 转染后各组细胞中 IL-8蛋白表达水平

图3 IL-8对HNEC凋亡的影响

3 讨 论

鼻息肉的发病机制目前尚不清楚，手术治疗效果虽然有所提高，但病人术后仍有复发。目前研究认为鼻息肉的形成是由多种因素共同参与的慢性炎症〔2〕。且有研究显示，多种细胞因子影响了鼻息肉的发生及病理过程〔3〕。IL-8是一种炎性细胞因子，可诱导嗜酸性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞迁移到炎症或感染部位，在损伤、感染患者的血清中可发现IL-8的高表达〔4〕。研究显示，在鼻息肉匀浆组织中检测到IL-8的表达水平显著高于对照组，在慢性鼻窦炎患者的窦黏膜也可检测IL-8的高表达〔5〕。本研究中也检测IL-8在鼻息肉组织中的高表达，其结果与前人的研究一致。RNA干扰是由双链DNA引起的一种序列特异性的基因沉默，作为下调基因的工具已被广泛用于基因功能的研究及疾病的治疗〔6〕。本研究结果显示，沉默IL-8的表达能促进HNEC的凋亡及酶切caspase3蛋白的表达。细胞凋亡是细胞在受到各种刺激因素后所发生的程序性死亡过程，其过程受到多种基因的调控。其中以caspase家族及Bcl-2家族为主。caspase3位于caspase所介导的蛋白酶级联反应的下游，通常以非活化的酶原形式在细胞质中存在，其激活后可降解多种蛋白质底物，从而诱导细胞的凋亡〔7〕。本研究结果说明沉默IL-8的表达通过上调酶切caspase3蛋白的表达诱导HNEC的凋亡。

1Visciano C，Liotti F，Prevete N，etal.Mast cells induce epithelial-to-mesenchymal transition and stem cell features in human thyroid cancer cells through an IL-8-Akt-Slug pathway〔J〕.Oncogene，2015；34(40)：5175-86.

2王成硕，娄鸿飞，孟一帆，等.组织普酸粒细胞增多对慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉复义的预测价值研究〔J〕.中华耳鼻咽喉头颅外科杂志，2016；51(4)：268-72.

3Wang LF，Chien CY，Tai CF，etal.Vitamin D decreases the secretion of eotaxin and RANTES in nasal polyp fibroblasts derived from Taiwanese patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps〔J〕.Kaohs J Med Sci，2015；31(2)：63-9.

4Beigelman A，Isaacson-Schmid M，Sajol G，etal.Randomized trial to evaluate azithromycin′s effects on serum and upper airway IL-8 levels and recurrent wheezing in infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2015；135(5)：1171-8.

5Okano M，Fujiwara T，Kariya S，etal.Regulatory effect of TLR3 signaling on staphylococcal enterotoxin-induced IL-5，IL-13，IL-17A and IFN-γ production in chronic rhinosinusitis with nasal polyps〔J〕.Allergol Int，2016；65(1)：96-102.

6王 婷，高玉珍，沈明志，等.条件性 RNA 干扰技术研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2015；15(3)：547-50.

7林 欢，冷吉燕，于 静，等.蓝莓花色苷对人脐静脉内皮细胞凋亡调控基因 Bax，Caspase-3 表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(15)：4157-8.

〔2017-04-15修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

R765.2

A

1005-9202(2017)22-5564-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.034

郑慧媛(1975-)，女，硕士，主治医师，主要从事鼻腔鼻窦肿瘤研究。